Mois : mai 2023

B : Pourrais-tu nous parler de ta discipline de recherche ?

PC : Je travaille à la frontière entre la microbiologie et la biologie cellulaire. Depuis 1986, je m’intéresse aux infections par des bactéries qui vivent à l’intérieur des cellules ; cela m’a conduite à des études sur les bactéries (de la microbiologie), et sur les cellules (de la biologie cellulaire), et sur la façon dont les bactéries pénètrent et vivent dans les cellules, que ce soit au niveau des tissus ou des organismes entiers.

En général, après avoir analysé des mécanismes sur des cellules en culture, nous validons nos résultats sur des modèles animaux pour comprendre la maladie humaine. On est à la limite de la médecine, mais ce qui m’intéresse surtout, ce sont les mécanismes fondamentaux : comprendre comment un microbe provoque une maladie, comment une maladie s’installe, comment des maladies donnent des signes cliniques, et comment l’organisme peut échapper à cette maladie.

A l’époque de Pasteur, à la fin du XIXe siècle, les microbiologistes cherchaient à identifier le microbe responsable de telle ou telle maladie (peste ou choléra ?). Maintenant on cherche à comprendre comment un microbe produit une maladie.

Il y a différentes catégories de microbes : des bactéries, des parasites, des virus. Nous travaillons sur les bactéries qui sont des cellules uniques (des petits sacs) sans noyau mais qui ont un chromosome. Les mammifères (nous !), les plantes ont des millions de cellules différentes qui ont un noyau contenant des chromosomes. Les chromosomes sont faits d’ADN, composé qui a été découvert dans les années 50. Il a ensuite été établi que l’ADN était la molécule essentielle pour la transmission du patrimoine génétique, le génome. L’ADN, c’est la molécule de la vie !

Parmi les bactéries certaines sont inoffensives, d’autres sont pathogènes !

C’est pour leurs travaux ici, à l’Institut Pasteur, sur des bactéries non pathogènes et sur leur ADN que François Jacob, Jacques Monod et André Lwoff ont obtenu le prix Nobel. Ils s’intéressaient au chromosome bactérien et à la façon dont les bactéries en se nourrissant, produisent des protéines, grandissent, et se divisent en deux (division binaire !) en générant une descendance identique à la bactérie initiale.

À la fin des années 70, on a assisté à l’explosion de la biologie moléculaire, c’est à dire la biologie des molécules, héritée de la découverte de l’ADN. À la fin des années 80, les chercheurs en biologie moléculaire cherchaient à comprendre comment les molécules fonctionnent, alors que les chercheurs en biologie cellulaire s’intéressaient à la façon dont les cellules fonctionnent.

J’étais chercheuse à ce moment clé. Il y avait des avancées du côté bactéries, et aussi du côté des cellules de mammifères, grâce en particulier aux nouveaux microscopes. On pouvait donc commencer à observer des infections par les bactéries pathogènes. On pouvait combiner biologie moléculaire et biologie cellulaire, en essayant de comprendre les interactions entre composants bactériens ou ceux de la cellule hôte dans le cas d’infections. C’est sur cela qu’ont porté alors mes travaux. Cela a conduit à l’émergence d’une nouvelle discipline que nous développions, qui s’intéressait en particulier à ce qui se passe dans les cellules quand arrive un corps étranger. Pendant un colloque que j’ai organisé sur ce sujet, un journaliste de Science nous a conseillé de donner un nom à cette discipline : nous avons proposé la microbiologie cellulaire. J’ai fait partie des lanceurs de cette discipline, la microbiologie cellulaire.

Cette discipline a été rapidement acceptée, avec un livre fondateur, des revues, et aujourd’hui des professeurs et des départements de microbiologie cellulaire.

B : Pourrais-tu nous expliquer en quoi consiste le travail dans ce domaine ?

PC : Quand une bactérie essaie d’entrer dans une cellule, la bactérie s’adapte à la cellule et vice versa. Le travail dans le domaine consiste à observer la bactérie qui rentre et parfois se promène dans la cellule, on la filme. On choisit plutôt des cellules faciles à cultiver, et pour la bactérie, j’ai choisi Listeria monocytogenes. Je l’ai choisie avec soin pour ses propriétés uniques. On la trouve dans l’environnement ; elle peut parfois contaminer des aliments, et ainsi par l’alimentation atteindre dans le tractus intestinal, parfois traverser la barrière intestinale et arriver au foie, à la rate, ou au placenta et éventuellement au cerveau. Elle est capable d’aller jusqu’au fœtus. Elle cause des gastroentérites, des accouchements prématurés, des méningites. On a beaucoup avancé dans la connaissance du processus infectieux mais on ne comprend encore pas bien comme elle va jusqu’au cerveau.

Plus concrètement, dans un labo, on cultive la bactérie dans des tubes contenant un liquide nutritif. On cultive soit la bactérie originale soit des mutants de la bactérie. Dans un autre coin du labo, on fait pousser des cellules. La suite dépend de la question qu’on se pose. En général on met les bactéries ou les mutants sur les cellules et on observe ce qui se passe ou ce qui ne se passe pas avec certains mutants.

On peut aussi infecter des animaux, ce qui est bien sûr très règlementé. Si j’injecte la bactérie par voie orale dans une souris, est-ce qu’elle arrive au foie ? Comment la souris réagit-elle ? On a une multitude de questions à poser.

B : Tu te doutes que Binaire s’intéresse aux apports du numérique dans ta discipline.

PC : On a vécu une double révolution avec le numérique : du côté de la bactérie avec la génomique, et du côté de la cellule et de l’infection, avec l’imagerie numérique.

B : Commençons par la génomique si tu veux bien.

PC : Les bactéries n’ont pas de noyau, Elles ont un chromosome, c’est-à-dire un grand ADN circulaire. Au début de mes travaux sur Listeria, on ne connaissait rien sur son chromosome, c’est-à-dire son génome. Pour le comprendre, on a d’abord créé des mutants, avec différents outils génétiques : par exemple on peut mettre la bactérie Listeria à côté d’une autre bactérie qui va injecter dans son ADN, un transposon. On obtient alors une « banque de mutants » parmi lesquels on cherche, par exemple, un mutant non invasif, c’est-à-dire qui ne parvient pas à entrer dans les cellules.

L’ADN consiste en une séquence de lettres. Pour trouver l’endroit où le gène a été interrompu, on réalise le « séquençage » de l’ADN situé à côté du transposon. Les différentes techniques de séquençage de l’ADN sont apparues vers la fin des années 70. Au début on ne pouvait séquencer que des petits fragments. J’ai réalisé à l’époque mon premier séquençage, avec une technique chimique. Je lisais les séquences et j’écrivais les résultats dans un cahier.

Et puis, on a obtenu des séquences de plus en plus longues qu’on a entrées dans des ordinateurs. On a pu utiliser des programmes pour trouver des ressemblances entre des séquences. On pouvait « aligner des séquences », c’est-à-dire les positionner pour en faire ressortir les régions similaires. L’informatique nous permettait de faire ce qu’on n’arrivait plus à faire à la main, quand les séquences grandissaient.

Les techniques ont alors progressé et dans le cadre d’un consortium européen que je dirigeais, nous avons publié en 2000 le séquençage du génome de Listeria qui comporte 3 millions de lettres. À titre de comparaison, le génome humain, qui a été séquencé plus tard, a 3 milliards de lettres. Au début, le travail de séquençage était lent et considérable, il exigeait de faire collaborer plusieurs labos, chacun travaillant dans son coin sur certaines régions de l’ADN chromosomique. L’ordinateur est devenu indispensable pour assembler les morceaux de séquences et analyser les résultats.

Nous avons donc séquencé le génome de Listeria monocytogenes, l’espèce pathogène, et aussi celui d’une cousine non-pathogène, Listeria innocua. L’observation des différences entre les séquences a été une mine d’or de découvertes. La comparaison des deux génomes ouvrait une infinité de possibilités d’expériences. On pouvait réaliser des mutations ciblées, en inactivant tel ou tel gène, présent chez L. monocytogenes et absent chez Listeria innocua et tester si le mutant obtenu était encore virulent.

Il reste beaucoup de travail à faire, notamment, sur des bactéries pour lesquelles on ne sait pas grand-chose, en particulier, parce qu’on ne sait pas les cultiver, comme c’est le cas pour les bactéries anaérobies de l’intestin, du sol ou des océans

La grande révolution à l’heure actuelle, c’est la métagénomique. Les machines sont devenues très performantes pour séquencer l’ADN. Elles séquencent des mélanges d’ADN et sont capables d’identifier tous les ADN différents présents et donc les espèces d’où ils proviennent. Par exemple, dans la mission Tara, une goélette récolte du microbiome marin. Les séquenceurs vont être capables d’identifier des milliers de petits bouts de séquences d’ADN. Un logiciel va faire le catalogue des espèces présentes. Tout ceci serait impensable sans ordinateur.

B : Est-ce qu’un séquençage prend beaucoup de temps ?

PC : Avant, en 2000, séquencer un génome bactérien prenait au moins dix-huit mois. Maintenant, en trois jours on a la séquence et les premières analyses. L’ordinateur sait comparer deux génomes l’un à l’autre, ou encore comparer un génome à une banque de génomes. Il sait « regarder » le génome et faire son « analyse grammaticale », identifier les gènes et donc les protéines que ces gènes peuvent produire. C’est une révolution. Des tâches qui auraient pris des années pour des humains sont maintenant faites très rapidement par des ordinateurs.

Cela nous permet maintenant de nous tourner vers les microbiotes, ces grandes assemblées de micro-organismes. On peut analyser les microbiotes de l’intestin, la bouche, l’environnement (les sols, les océans)… Cela ouvre des possibilités extraordinaires comme de comprendre pourquoi certaines personnes sont malades, pourquoi certains sols sont stériles.

B : Nous pourrions maintenant passer aux apports de l’imagerie cellulaire.

PC : Le passage de l’observation des images par l’homme à l’analyse des images par l’ordinateur a fait passer les conclusions tirées, du stade subjectif au stade objectif : deux cellules ne sont jamais identiques. Le scientifique pouvait observer par exemple qu’une bactérie semblait entrer mieux ou plus vite dans une cellule que dans une autre. Mais cette observation était relativement subjective. Il était difficile de la rendre objective : alors on refaisait des manips des milliers de fois et on calculait des moyennes. Ceci prenait un temps fou. L’imagerie numérique nous permet d’observer de nombreuses cellules en même temps. La microbiologie cellulaire est une discipline qui a évolué considérablement avec le numérique.

Les techniques d’imagerie reposent sur l’usage de marqueurs fluorescents avec lesquels on peut marquer la membrane extérieure de la cellule, ou le noyau, ou les mitochondries, etc. On utilise des programmes qui ressemblent aux programmes de reconnaissance faciale pour reconnaitre les marqueurs fluorescent qu’on a placés. On peut répondre à des questions comme : en combien de temps la bactérie va-t-elle arriver au noyau ? L’imagerie numérique est beaucoup plus sensible que l’œil humain, elle nous donne accès à des événements qui auraient échappé à l’observation à l’œil nu.

On obtient de plus en plus de données qu’on peut stocker. On fait des analyses statistiques sur ces données pour répondre à différents types de questions qui permettent de comprendre dans notre cas les facteurs qui sont critiques pour qu’une infection prenne place.

B : Tu nous as dit qu’il y avait une multitude de questions à poser. On ne peut pas les poser toutes. Il faut choisir. La sérendipité joue-t-elle un rôle pour trouver réponse à des questions intéressantes ?

PC : Oui, très important. Pasteur disait à peu près : la science sourit aux esprits préparés ! J’ai eu une grande chance dans ma vie, c’est de trouver un mutant de Listeria que je ne cherchais pas. C’était en 1990. Ça a été une histoire incroyable.

Un collègue, Dan Portnoï avait découvert grâce à ses travaux en microscopie électronique, la capacité exceptionnelle de Listeria à se mouvoir à l’intérieur des cellules et à passer d’une cellule à l’autre. Son résultat avait passionné les biologistes cellulaires qui cherchaient à comprendre comment en général les cellules bougent par exemple lors du développement d’un organisme.

C’était l’époque pré génomique. Je cherchais dans une banque de mutants un mutant qui, sur des boîtes de Pétri, ne faisait pas de halo dans du jaune d’œuf. Rien à voir donc a priori. Et je trouve un mutant qui ne fait plus ce halo. Je demande à une postdoc de vérifier au microscope si cette bactérie passe bien d’une cellule à l’autre. Elle m’appelle alors qu’elle était au microscope : « Viens voir ! » Ce mutant était incapable de motilité intracellulaire. En l’analysant, nous avons trouvé le gène et donc la protéine responsables de la motilité. Le hasard m’a donc permis de réaliser une belle avancée en biologie cellulaire, parce que ça a permis de comprendre non seulement la motilité des bactéries mais aussi celle des cellules de mammifères.

Mais pour une telle histoire, il fallait savoir profiter de l’occasion. Dans notre métier, on doit en permanence se poser des questions précises, évaluer si elles sont importantes et si on a les moyens techniques pour y répondre. Il faut aussi sans cesse être aux aguets de choses inattendues !

B : Est-ce que le numérique continue à transformer le domaine.

PC : Oui. Récemment on a vu des applications dans la prédiction des structures de protéines avec Alphafold. La cristallographie de protéines et l’analyse de diffusion de rayons X sur les cristaux de protéines nous permettaient de comprendre leurs structures 3-dimensionnelles, c’est à dire le repliements de protéines dans l’espace. On pouvait ensuite essayer de prédire comment des protéines s’assemblent, mais c’était très compliqué et à petite échelle. On pouvait aussi essayer de prédire comment inhiber la fonction d’une protéine en introduisant un composé dans un endroit clé pour toute la structure de la protéine.

Alphafold part d’énormes bases de données sur les structures tridimensionnelles de protéines. Dans les programmes d’Alphafold, des logiciels d’apprentissage automatique (machines learning) combinent toute une gamme de techniques pour prédire comment un repliement pourrait de produire, et proposent des configurations spatiales aux scientifiques. Cela ouvre des possibilités fantastiques pour comprendre comment fonctionnent les protéines, et a donc des potentialités médicales incroyables.

Serge Abiteboul et Claire Mathieu

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