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AUS DER KLINIK F�R NEUROLOGIE
DER PHILIPPS-UNIVERSIT�T MARBURG
DIREKTOR: PROF. DR. W. H. OERTEL
Mutationen im PTS-Gen
und m�gliche Auswirkungen auf Funktion
und Struktur der
6-Pyruvoyl-Tetrahydropterin-Synthase
INAUGURAL-DISSERTATION
zur
Erlangung des Doktorgrades der Zahnmedizin
dem Fachbereich Humanmedizin der
Philipps-Universit�t Marburg
vorgelegt
von
Friedrich-Alexander Preu�e
aus Kiel
Marburg 2001
Page 2
Angenommen vom Fachbereich Humanmedizin
der Philipps-Universit�t Marburg am 16.05.2002
gedruckt mit Genehmigung des Fachbereichs
Dekan: Prof. Dr. R. Arnold
Referent: PD Dr. O. Bandmann
Coreferent: Prof. Dr. L. Flores de Jacobi
Page 3
Inhaltsverzeichnis
III
INHALTSVERZEICHNIS
Kapitel I : Einleitung.......................................................................................................1
A. Historischer �berblick......................................................................................................1
B. Biochemische Grundlagen des BH4-Stoffwechsels
und der 6-Pyruvoyl-Tetrahydropterin-Synthase ............................................................4
1. Funktionelle Bedeutung von BH4 .............................................................................4
1.1 Bedeutung von Tetrahydrobiopterin
f�r den Phenylalanin-Metabolismus......................................................................5
1.2 Das Phenylalanin-Hydroxylase-System................................................................8
2. Die Biosynthese von BH4 ..........................................................................................9
3. Die 6-Pyruvoyl-Tetrahydropterin-Synthase...........................................................11
3.1 Allgemeine Aspekte ............................................................................................11
3.2 Struktur der PTPS...............................................................................................11
3.3 Struktur des PTS-Gens.......................................................................................17
C. Klinische und molekulare Grundlagen des PTPS-Mangels ........................................20
1. Hyperphenylalanin�mie durch BH4-Mangel...........................................................20
1.1 Allgemeine Aspekte und die
unterschiedlichen Enzymdefekte ........................................................................20
1.2 Klinik des PTPS-Mangels ...................................................................................22
2. Diagnostik.................................................................................................................23
2.1 Phenylalaninmessung.........................................................................................23
2.2 BH4-Belastungstest.............................................................................................24
2.3 Messung der Pterine...........................................................................................25
2.4 Neurotransmittermetabolite.................................................................................27
2.5 Enzymaktivit�t.....................................................................................................27
2.6 Pr�nataldiagnostik ..............................................................................................28
2.7 Molekulargenetische Diagnostik .........................................................................29
3. Genetik des PTPS-Mangels.....................................................................................29
4. Therapie....................................................................................................................33
5.Prognose ...................................................................................................................35
D. Ziele der Untersuchung..................................................................................................36
Page 4
Inhaltsverzeichnis
IV
Kapitel II : Methodik......................................................................................................37
A. Angewandte Methoden...................................................................................................37
1. Allgemeine Betrachtung..........................................................................................37
2. DNA-Extraktion ........................................................................................................38
2.1 Aus peripheren Lymphozyten .............................................................................38
2.2 Aus Guthrie-Karten .............................................................................................38
3. Die Polymerasekettenreaktion (PCR).....................................................................39
4. Enzymverdau zur Detektion von Mutationen ........................................................40
5. Sequenzierung der PCR-Produkte .........................................................................41
6. R�umliche Darstellung der ver�nderten Proteine.................................................42
B. Materialien und Protokolle .............................................................................................43
1. DNA-Extraktion ........................................................................................................43
1.1 Materialien .......................................................................................................... 43
1.2 DNA-Extraktion aus Vollblut................................................................................43
1.3 Bestimmung der DNA-Konzentration und Reinheit.............................................44
1.4 DNA-Extraktion aus Guthrie-Karten....................................................................44
2. Primersequenzen.....................................................................................................45
2.1 Primer f�r die Amplifikation der 6 PTS-Exons.....................................................45
2.2 Die markierten Universalprimer
f�r die Cycle-Sequencing-Reaktion .................................................................... 45
2.3 Modifizierter R�ckw�rtsprimer
f�r den Enzymverdau in Exon 2..........................................................................45
3. Die Polymerasekettenreaktion (PCR).....................................................................46
3.1 PCR-Reagenzien ................................................................................................ 46
3.2 PCR Ansatz und Konditionen .............................................................................46
4. Enzymverdau............................................................................................................48
4.1 Materialien .......................................................................................................... 48
4.2 Methode..............................................................................................................48
5. Agarose Gelelektrophorese der PCR-Produkte ....................................................49
5.1 Materialien .......................................................................................................... 49
5.2 Methode..............................................................................................................49
6. Sequenzierung der DNA..........................................................................................50
6.1 Materialien .......................................................................................................... 50
6.2 Cycle-Sequencing...............................................................................................50
6.3 Herstellung des Polyacrylamid-Gels ...................................................................52
6.4 Sequenzierungs-Elektrophorese.........................................................................52
C. Patientendaten ................................................................................................................54
Page 5
Inhaltsverzeichnis
V
Kapitel III : Ergebnisse ................................................................................................58
A. �bersicht der gefundenen Mutationen .........................................................................58
B. Sequenzen.......................................................................................................................61
R17_I18insR (Exon 1)....................................................................................................61
A22G (Exon 1) ...............................................................................................................63
R25Q (Exon 1) ............................................................................................................... 64
E35G (Exon 2) ...............................................................................................................65
Poly-T-Segment.............................................................................................................67
F40fsX56 (Exon 2) ......................................................................................................... 68
IVS2+14t>c (Intron 2).....................................................................................................70
P87L (Exon 5) ................................................................................................................ 71
Y99X (Exon 5)................................................................................................................72
A101V (Exon 5)..............................................................................................................73
Y113C (Exon 6) .............................................................................................................74
G125R (Exon 6) ............................................................................................................. 75
D136G (Exon 6) ............................................................................................................. 76
N138H (Exon 6) .............................................................................................................77
Kapitel IV : Diskussion................................................................................................78
A. Allgemeines.....................................................................................................................78
B. Mutationen.......................................................................................................................81
R17_I18insR (Exon 1 ; Pat. 03) .....................................................................................81
A22G (Exon 1 ; Pat 01)..................................................................................................83
R25Q (Exon 1 ; Pat. 08).................................................................................................85
E35G (Exon 2 ; Pat. 02).................................................................................................88
F40fsX56 (Exon 2 ; Pat. 9).............................................................................................89
IVS2+14t>c (Intron 2 ; Pat. 08) ......................................................................................90
P87L (Exon 5 ; Pat. 04)..................................................................................................90
Y99X (Exon 5 ; Pat. 05 + 09) .........................................................................................91
A101V (Exon 5 ; Pat. 05) ...............................................................................................92
Y113C (Exon 6 ; Pat. 04) ...............................................................................................93
G125R (Exon 6 ; Pat. 07)...............................................................................................94
D136G (Exon 6 ; Pat. 3).................................................................................................96
N138H (Exon 6 ; Pat. 6).................................................................................................98
Page 6
Inhaltsverzeichnis
VI
C. Patienten .........................................................................................................................100
Patient 01 ......................................................................................................................100
Patient 02 ......................................................................................................................101
Patient 03 ......................................................................................................................101
Patient 04 ......................................................................................................................102
Patient 05 ......................................................................................................................104
Patient 06 ......................................................................................................................105
Patient 07 ......................................................................................................................105
Patient 08 ......................................................................................................................106
Patient 09 ......................................................................................................................107
D. Schlu�betrachtung ........................................................................................................108
V. Zusammenfassung.................................................................................................111
VI. Literaturverzeichnis..............................................................................................113
Verzeichnis der akademischen Lehrer.............................................................................126
Danksagung ........................................................................................................................127
Page 7
Abk�rzungen
VII
ABK�RZUNGEN
5HIA
5-Hydroxyindolacetat
AR
Aldose-Reduktase
AS
Aminos�ure
ARMS
Amplification refractory
mutation system
ATP
Adenosintriphosphat
Bio
Biopterin
BH4
Tetrahydrobiopterin
bp
Basenpaare
cDNA
komplement�re DNA
ddNTP
Didesoxynukleosidtriphosphat
DGGE
Denaturierungs-Gradienten-
Gelelktrophorese
DHPR
Dihydropterin-Reduktase
DNA
Desoxyribonukleins�ure
dNTP
Desoxynukleosidtriphosphat
gDNA
genomische DNA
GTP
Guanosintriphosphat
GTPCH
GTP-Cyclohydrolase
HVA
Homovanillins�ure
HPA
Hyperphenylalanin�mie
HPLC
High-performance liquid
chromatography
IFN-γ
Interferon-γ
kb
Kilobase
mRNA
messenger-RNA
Neo
Neopterin
PAH
Phenylalanin-Hydroxylase
PCD
Pterin-4α-Carbinolamin-
Dehydratase
PCR
Polymerasekettenreaktion
PDB
Protein Data Bank
Phe
Phenylalanin
PKU
Phenylketonurie
PTPS
6-Pyruvoyl-Tetrahydropterin-
Synthase
RNA
Ribonukleins�ure
SR
Sepiapterin-Redukase
TH
Tyrosin-Hydroxylase
TNF-α
Tumor-Nekrosefaktor-α
TPH
Tryptophan-Hydroxylase
ZNS
Zentralnervensystem
Page 8
Kapitel I – A : Historischer �berblick
1
KAPITEL I : EINLEITUNG
A. Historischer �berblick
Die Erkrankung Phenylketonurie (PKU) bzw. Hyperphenylalanin�mie (HPA)
wurde erstmalig 1934 von dem norwegischen Biochemiker Asbj�rn F�lling
(F�lling 1994) beschrieben, der von der Mutter zweier geistig retardierter
Kinder wegen deren eigent�mlich riechenden Urins konsultiert wurde. Er
fand heraus, da� sich der Urin nach Zugabe von Eisenchlorid olivgr�n ver-
f�rbte. Die Untersuchung des Urins von 430 anderen mental retardierten Pa-
tienten ergab eine positive Reaktion bei acht weiteren Patienten.
Unter den insgesamt zehn betroffenen Patienten befanden sich vier Ge-
schwisterpaare, was F�lling zu der Annahme veranla�te, da� es sich um
eine erbliche Krankheit handeln mu�te.
Die f�r die Farbreaktion des Urins verantwortliche Substanz wurde als Phe-
nylpyruvat identifiziert, weshalb F�lling der neu entdeckten Krankheit den
Namen Imbecillitas Phenylpyrouvica gab (F�lling 1934). Die von Penrose
dann als Phenylketonurie (Penrose 1935; Penrose und Quastel 1937) be-
zeichnete Erkrankung wurde in zunehmendem Ma�e beobachtet. Man fand
heraus, da� eine hohe Serum-Phenylalanin-Konzentration die Ursache f�r
die Akkumulation des Phenylpyruvats im Urin ist (F�lling und Closs 1938).
1947 zeigte Jervis, da� bei Patienten mit PKU eine Verabreichung von Phe-
nylalanin nicht zu dem normalerweise zu beobachtenden Anstieg von Tyrosin
f�hrte. Das Enzym, welches diesen Reaktionsschritt katalysiert, ist die
Phenylalaninhydroxylase (PAH). Jervis schlo�, da� Funktionsst�rungen der
PAH f�r die Erkrankung verantwortlich sind (Jervis 1947).
1953 wurde PKU erstmalig durch eine phenylalaninarme Di�t erfolgreich be-
handelt (Bickel et al. 1953; Bickel et al. 1954).
Die M�glichkeit der Therapie verlangte nach einer einfachen Methode, die
Erkrankung schnell zu diagnostizieren, zumal eine Di�t so fr�h wie m�glich
Page 9
Kapitel I – A : Historischer �berblick
2
nach der Geburt erfolgen sollte, um irreversible geistige Sch�den zu vermei-
den. Guthrie und Susie f�hrten den sogenannten Guthrie-Test ein, der sich
zum fl�chendeckenden Neugeborenen-Screening eignete und als Massen-
untersuchung f�r alle Neugeborenen etabliert wurde (Guthrie und Susie
1963). Es ist inzwischen nachgewiesen, da� bei fr�her Diagnose und Be-
handlung eine normale intellektuelle Entwicklung zu erwarten ist (Williamson
et al. 1981) und da� der erreichbare IQ eines Kindes im umgekehrten Ver-
h�ltnis zum Alter steht, in dem die Di�t begonnen wurde (Koch, Wenz 1987).
In seltenen F�llen schlug eine phenylalaninarme Di�t allerdings als Therapie
nicht an. Man bezeichnete diese Form der Phenylketonurie als „atypische“
oder „maligne“ PKU (Danks 1979; Danks 1987). Au�erdem beobachtete man
bei diesen Patienten zus�tzliche neurologische St�rungen wie Tremor oder
tonisch-klonische Kr�mpfe.
Man stellte fest, da� hierf�r ein Mangel des Coenzyms Tetrahydrobiopterin
(BH4) verantwortlich war. BH4 ist essentieller Cofaktor f�r PAH sowie andere
wichtige Hydroxylasen, wie Tyrosinhydroxylase (TH) und Tryptophanhy-
droxylase (TPH) (f�r weitere biochemische Informationen siehe Kapitel I – B).
1969 wurden zwei Patienten von Tada beschrieben, bei denen die herk�mm-
liche Therapie zu keiner Verbesserung f�hrte (Tada et al. 1969). Die Erkran-
kung der Patienten mit milder Hyperphenylalanin�mie wurde damals als eine
„genetische Variante der Phenylketonurie“ beschrieben, jedoch sp�ter als ein
Mangel der Dihydropteridin-Reduktase (DHPR) charakterisiert (Tada et al.
1980).
1974 beschrieb Smith in London drei Kinder mit „PKU“, die einen ungew�hn-
lichen Verlauf der Erkrankung aufwiesen (Smith, Lloyd 1974). Trotz fr�hzeiti-
ger Diagnose und Behandlung mit phenylalaninarmer Di�t entwickelten diese
Patienten eine progressive neurologische Erkrankung und starben. Unab-
h�ngig davon berichtete Bartholom� in Heidelberg von einem �hnlichen Fall
„atypischer“ PKU, bei der die Di�tbehandlung keinen Erfolg zeigte (Bartho-
lom� 1974). Der atypische Verlauf, die hohe Toleranz f�r Phenylalanin und
normale PAH-Aktivit�t im Lebergewebe des Patienten f�hrten zu der Speku-
Page 10
Kapitel I – A : Historischer �berblick
3
lation, da� das Syndrom eine neue Form der HPA sei, die durch einen De-
fekt im BH4-Metabolismus ausgel�st w�rde. Smith schlu�folgerte, da� ein
Defekt des BH4-Metabolismus im Gehirn ebenso in einem gest�rten Umsatz
der Neurotransmitter L-Dopa, Noradrenalin, Adrenalin und Serotonin resultie-
ren m�sse (Smith 1974), da f�r deren Synthese die BH4-abh�ngigen Hy-
droxylasen TH und TPH ben�tigt werden.
In den folgenden Jahren wurden zahlreiche F�lle von BH4-Mangel ver�ffent-
licht (Smith et al. 1975; Bartholom� et al. 1977; Brewster et al. 1976; Butler et
al. 1975; Danks et al. 1975; Danks et al. 1976; Kaufman et al. 1975; Rey et
al. 1976).
Auf der Annahme basierend, Pterine k�nnten f�r die Behandlung n�tzlich
sein, wurde vorgeschlagen, an BH4-Mangel erkrankte Patienten mit redu-
zierten Pterinen zu behandeln (Smith et al. 1975). Tats�chlich konnte gezeigt
werden, da� intraven�s verabreichtes synthetisches BH4 die Serum-Phe-
Konzentration senkt und somit in vivo als Cofaktor der hepatischen Phenyl-
alanin-Hydroxylase fungiert (Danks et al. 1976). Allerdings kann BH4 die Blut-
Hirn-Schranke nicht in ausreichender Menge �berschreiten (Gal et al. 1976).
Zur Behandlung der zentralnerv�sen St�rung werden aus diesem Grund
Vorl�ufersubstanzen von Neurotransmittern wie L-Dopa und 5-Hydroxy-
tryptophan verabreicht (Danks et al. 1975;. Bartholom�, Byrd 1975; Butler et
al. 1981; Endres et al. 1982a; Endres et al. 1982b; Kaufman et al. 1982;
McInnes et al. 1984; Niederwieser et al. 1982; Schaub et al. 1978).
Inzwischen sind �ber 400 F�lle von BH4-Mangel weltweit bekannt, die alle
durch einen Defekt der an der Synthese bzw. Regenerierung von BH4 betei-
ligten Enzyme ausgel�st werden.
Von den am BH4-Metabolismus beteiligten Enzymen weist die 6-Pyruvoyl-
Tetrahydropterin-Synthase (PTPS) mit knapp 60% am h�ufigsten einen De-
fekt auf (Blau et al. 1993). Urs�chlich f�r die Fehlfunktion sind autosomal re-
zessive Mutationen im PTS-Gen (Th�ny et al. 1994a; Oppliger et al. 1995a).
Page 11
Kapitel I – B : Biochemische Grundlagen des BH4-Stoffwechsels
4
B. Biochemische Grundlagen des BH4-Stoffwechsels und
der 6-Pyrovoyl-Tetrahydropterin-Synthase
1. Funktionelle Bedeutung von BH4
Tetrahydrobiopterin (BH4) ist essentieller Cofaktor der Phenylalanin-
Hydroxylase (PAH) sowie der Tyrosin-3-Hydroxylase und der Tryptophan-5-
Hydroxylase (Nichol et al. 1985). Die beiden letztgenannten Enzyme sind
Schl�sselenzyme in der Biosynthese biogener Amine (Scriver et al. 1994):
Die Tyrosin-3-Hydroxylase katalysiert die Hydroxylierung von Tyrosin zu
L-DOPA, die Vorl�ufersubstanz f�r Dopamin und Noradrenalin; die
Tryptophan-5-Hydroxyase ist f�r die Hydroxylierung von Tryptophan zu
5-OH-Tryptophan, der Vorstufe von Serotonin, erforderlich (Kaufman, 1993)
(Abb.1.1).
Aus diesem Grunde verursachen Defekte in der Synthese oder Regenerie-
rung von BH4 nicht nur eine Hyperphenylalanin�mie, sondern auch einen
Mangel der monoaminen Neurotransmitter, der klinisch zu den charakteristi-
schen progressiven neurologischen St�rungen f�hrt (Scriver et al., 1995).
Dies l��t sich diagnostisch vor allem auch durch die quantitative Bestimmung
der Neurotransmitter und ihrer Abbauprodukte (HVA, 5HIA) nachweisen.
Tyrosin
Tryptophan
L-DOPA
5-OH-Tryptophan
BH4
Dihydro-
biopterin
TH
TPH
Dopamin
Serotonin
HVA
5HIA
Abb. 1.1: BH4 als Cofaktor bei der Hydroxylie-
rung von Tyrosin und Tryptophan. TH: Tyrosin-
Hydroxylase; TPH: Tryptophan-Hydroxylase, HVA:
Homovanillins�ure, 5HIA: 5-Hydroxyindolacetat
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Kapitel I – B : Biochemische Grundlagen des BH4-Stoffwechsels
5
Zus�tzlich zu seiner Funktion bei der Hydroxylierung biogener Amine ist BH4
als Cofaktor f�r die Stickstoffoxid-Synthase (Marletta, 1993) und die Glyceryl-
Ether-Monooxygenase (Kaufman et al. 1990) erforderlich.
Zudem ist BH4 in Prozesse wie Wachstumskontrolle, zellvermittelte Immuni-
t�t, Antioxidation und Melanogenese involviert (Kaufman 1993; Anastasiadis
et al. 1996; Kojima et al. 1995; Schallreuter et al. 1998)
Die Beteiligung von BH4 an all diesen Reaktionen beruht auf der F�higkeit
des Molek�ls, mit molekularem Sauerstoff zu reagieren und so ein aktives,
instabiles Sauerstoff-Intermediat zu bilden (Abb. 1.2), welches seinerseits in
der Lage ist, verschiedene Substrate zu hydroxylieren.
Abb. 1.2: Bindung von molekularem O2 an BH4
Bei der Hydroxylierung des Substrates verliert das Coenzym zwei Elektronen
und wird in vivo in einer NADH-abh�ngigen Reaktion wieder regeneriert
(Abb. 1.2).
1.1 Bedeutung von Tetrahydrobiopterin f�r den Phenylalanin-Metabolismus
Phenylalanin (α-amino-β-phenyl-Propions�ure, Phe, Abb. 1.3) ist eine unpo-
lare, hydrophobe, aromatische Aminos�ure, die f�r den menschlichen K�rper
essentiell ist (d.h. nicht vom K�rper selbst synthetisiert werden kann).
Der Phenylalaninbedarf ist in den verschiedenen Altersgruppen unterschied-
lich. Kleinkinder ben�tigen bis zu 90 mg/kg/Tag, w�hrend 15 mg/kg/Tag f�r
einen jungen Erwachsenen ausreichen (Young und Pallett 1987). Der Bedarf
an Phenylalanin erh�ht sich automatisch, wenn nicht ausreichend Tyrosin zur
NH
O
H2N
N
N
N
H
CH
OH
CH
OH
CH3
H
5,6,7,8-Tetrahydrobiopterin
N
O
H2N
N
N
N
H
CH
OH
CH
OH
CH3
H
4α-Peroxy-Tetrahydrobiopterin
+O2
O
OH
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Kapitel I – B : Biochemische Grundlagen des BH4-Stoffwechsels
6
Verf�gung steht, welches vom K�rper aus Phenylalanin synthetisiert werden
kann. W�hrend des gesamten Lebens liegt der physiologische Plasma-Phe-
Spiegel unter 120 �mol/l.
Abb. 1.3: Phenylalanin
Der erste Schritt des normalen Katabolismus von Phenylalanin ist dessen
irreversible Hydroxylierung zu Tyrosin (Tyr). Die Hydroxylierung wird von
dem Enzym Phenylalanin-Hydroxylase (PAH) katalysiert.
Hierzu ist als Reduktionsmittel das Coenzym Tetrahydrobiopterin (BH4)
erforderlich (Abb. 1.2+4+6). Dieser Schritt ist entscheidend f�r den Abbau
von Phenylalanin, weil kein anderer Mechanismus f�r die Spaltung des aro-
matischen Ringes von Phenylalanin existiert (Milstien und Kaufman 1975).
Wird dieser Schritt beispielsweise durch einen Defekt von PAH oder Mangel
an BH4 blockiert, wie es bei der Phenylketonurie der Fall ist, beschr�nkt sich
die metabolische Transformation von Phenylalanin lediglich auf eine Decar-
boxylierung, Oxidation oder Transaminierung der Alanin-Seitenkette. Die
Produkte, die weiterhin einen Phenyl-Ring enthalten, werden dann mit dem
Harn ausgeschieden.
Der weitere Katabolismus von Tyrosin beinhaltet dessen Transaminierung zu
p-Hydroxy-Phenylpyruvat, Hydroxylierung, Oxidierung und intramolekulare
Umlagerung zu Homogentins�ure, Oxidation zu Maleylacetessigs�ure und
hydrolytische Spaltung in Fumars�ure und Acetoacetat.
Tyrosin ist eine Vorstufe der Thyroidhormone, der Neurotransmitter Dopa-
min, Adrenalin und Noradrenalin sowie des Pigments Melanin.
CH2
CH COO�
+NH3
Page 14
Kapitel I – B : Biochemische Grundlagen des BH4-Stoffwechsels
7
Abb. 1.4: Normaler Phenylalanin-Metabolismus
BH4: Tetrahydrobiopterin
CH2
CH COO�
+NH3
CH2
CH COO�
+NH3
BH4 + O2
Dihydrobiopterin + H2O
Phenylalanin-Hydroxylase
Phenylalanin
OH
CH2
C COO�
OH
O
Tyrosin
OH
OH
CH2
COO�
Thyroid-
Hormone
Melanin
Dopamin
Katechol-
amine
p-OH-Phenyl-
pyruvat
Hydroxylierung, Oxidierung,
Umlagerung des Molek�ls und
Spaltung des arom. Rings
�OOC CH CH COO�
H3C C CH2
O
COO�
Fumarat
Acetoacetat
Homogentisat
Tyrosintransaminase
p-Hydroxy-Phenylpyruvat-
hydroxylase
Homogenisin-
s�ureoxidase
Maleylacetessig-
s�ureisomerase
Page 15
Kapitel I – B : Biochemische Grundlagen des BH4-Stoffwechsels
8
1.2 Das Phenylalanin-Hydroxylase-System
Das Phenylalanin-Hydroxylase-System ist sehr komplex und besteht aus
mindestens vier Komponenten (Nichol et al. 1985; Curtius et al. 1985; Duch,
Smith 1991; Kaufman 1993): Drei Enzyme und das Coenzym Tetra-
hydrobiopterin (BH4) (Abb. 1.5). Die Hydroxylierung von Phenylalanin zu
Tyrosin wird von PAH als zentralem Enzym katalysiert. Dieses Enzym ist ei-
ne Monooxygenase bzw. eine mischfunktionelle Oxygenase, weil ein Atom
des O2 im Produkt und das andere im H2O auftaucht.
Als Reduktionsmittel dient das Coenzym Tetrahydrobiopterin, welches zu-
n�chst ein Sauerstoffatom an Phenylalanin abgibt, wodurch es zu
4α-hydroxy-Tetrahydrobiopterin umgewandelt wird (Lazarus et al. 1983). Das
n�chste Enzym, die Pterin-4α-Carbinolamin-Dehydratase (PCD) spaltet H2O
ab, wodurch der Cofaktor in das chinoide Dihydrobiopterin �bergeht (K�ster
et al. 1995; Rebrin et al.1995; Th�ny et al. 1995). Das letzte Enzym, die
Dihydrobiopterin-Reduktase (DHPR) regeneriert das Coenzym NADH-
abh�ngig wieder zu BH4, das wiederum O2 aufnehmen kann und erneut als
Cofaktor zur Verf�gung steht.
Abb. 1.5: Das Phenylalanin-Hydroxylase-System und Regenerierung von BH4. PAH: Phenylala-
nin-Hydroxylase, PCD: Pterin-4α-Carbinolamin-Dehydratase, DHPR: Dihydrobiopterin-Reduktase
5,6,7,8-Tetrahydrobiopterin
(BH4)
4α-Peroxy-Tetrahydrobiopterin
4α-Hydroxy-Tetrahydrobiopterin
(4α-Carbinolamin)
q-Dihydrobiopterin
O2
Phe
Tyr
H2O
NADH+H+
NAD+
DHPR
PAH
PCD
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Kapitel I – B : Biochemische Grundlagen des BH4-Stoffwechsels
9
2. Die Biosynthese von BH4
Neben der Regenerierung von BH4 ist die Biosynthese des Cofaktors aus
Guanosintriphosphat (GTP) m�glich (Abb. 1.6). Das erste Enzym, die GTP-
Cyclohydrolase (GTPCH) ist das Schrittmacherenzym des Syntheseweges
und katalysiert die Bildung von 7,8-Dihydroneopterin-triphosphat aus GTP in
einem einzigen Reaktionsschritt (Blau, Niederweiser 1985). GTPCH unter-
liegt einer Feedback-Inhibition durch BH4, �ber eine BH4-abh�ngige Kom-
plexbildung zwischen einem p35 Protein und GTPCH (Harada et al. 1993).
Diese Inhibition wird wiederum spezifisch durch Phenylalanin gehemmt, was
den hohen Biopterin- und Neopterin-Spiegel erkl�ren k�nnte, der bei Patien-
ten mit Phenylketonurie beobachtet wird. Desweiteren kann die Expression
von GTPCH auf Trankriptionsebene in T-Lymphozyten, Makrophagen und
Fibroblasten durch Zytokine wie Interferon-γ (IFN-γ) und Tumor-
Nekrosefaktor-α (TNF-α) stimuliert werden (Schoedon et al. 1987; Werner et
al. 1993).
Im zweiten Schritt katalysiert das Enzym 6-Pyruvoyl-Tetrahydropterin-
Synthase (PTPS) die Konversion von 7,8-Dihydroneopterin-triphosphat zu
6-Pyruvoyl-Tetrahydropterin (Nichol et al. 1985; Takikawa et al. 1986). Dieser
Umbauvorgang findet in Abh�ngigkeit von Magnesium und Zink statt und
umfa�t die Eliminierung von Triphosphat und eine intramolekulare Redox-
reaktion (B�rgisser et al. 1995).
W�hrend GTPCH in hohem Ma�e von dem p35 Protein reguliert wird, ist bis-
her f�r PTPS kein derartiger Regulationsmechanismus bekannt. Jedoch sind
bei PTPS posttranslationale Modifikationen wie beispielsweise Phosphorylie-
rung notwendig, um in vivo die vollst�ndige Aktivit�t zu erreichen (Oppliger et
al. 1995b).
Sepiapterin-Reduktase (SR) ist eine f�r den dritten Schritt erforderliche
NADPH-Oxidoreduktase, welche in zwei Stufen die Reduktion von
6-Pyruvoyl-Tetrahydropterin zu BH4 katalysiert (Smith 1987).
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Kapitel I – B : Biochemische Grundlagen des BH4-Stoffwechsels
10
NH
N
N
O
N
H2N
O
PPPOH2C
OH
OH
NH
O
H2N
N
N
N
H
CH
OH
CH
OH
CH2OPPP
NH
O
H2N
N
N
N
H
C
O
C
O
CH3
H
NH
O
H2N
N
N
N
H
C
O
CH
OH
CH3
H
NH
O
H2N
N
N
N
H
CH
OH
C
O
CH3
H
NH
O
H2N
N
N
N
H
CH
OH
CH
OH
CH3
H
GTPCH
2H2O
HCOOH
+Mg2+
OPPP+
+Zn2+
PTPS
GTP
6-Pyruvoyl-Tetrahydropterin
7,8-Dihydroneopterin-triphosphat
AR
NADPH+H+
NADP+
NADPH+H+
NADP+
SR
NADPH+H+
NADP+
SR
6-Laktoyl-Tetrahydropterin
1-OH-2-Oxopropyl-
Tetrahydropterin
NADPH+H+
NADP+
5,6,7,8-Tetrahydrobiopterin
AR
Abb. 1.6: De-novo-Synthese von BH4. GTPCH: GTP-Cyclohydrolase,
PTPS: 6-Pyruvoyl-Tetrahydropterin-Synthase, SR: Sepiapterin-Reduktase,
AR: Aldose-Reduktase
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Kapitel I – B : Biochemische Grundlagen des BH4-Stoffwechsels
11
3. Die 6-Pyruvoyl-Tetrahydropterin-Synthase
3.1 Allgemeine Aspekte
6-Pyruvoyl-Tetrahydropterin-Synthase (PTPS, EC 4.6.1.10) ist ein Zn2+-
abh�ngiges Metalloprotein und f�r den zweiten Schritt der de novo Biosyn-
these von 5,6,7,8-Tetrahydrobiopterin (BH4) aus GTP erforderlich (Duch,
Smith 1991). Die Reaktion beinhaltet einen Umbau des Substrats durch ei-
nen basisch katalysierten, internen Redox-Transfer und Eliminierung von
Triphosphat (Le Van et al. 1988).
W�hrend sich die GTPCH-Aktivit�t durch Zytokine um bis zu 100-fach stei-
gern l��t, wird die PTPS-Aktivit�t durch Zytokine nicht oder h�chstens um
den zwei- bis vierfachen Faktor verst�rkt (Th�ny et al. 2000). Es konnte ge-
zeigt werden, da� eine Phosphorylierung der humanen PTPS bei Ser-19 in
COS-1-Zellen zu einer mindestens 3-fachen Aktivit�tssteigerung f�hrt (Sche-
rer-Oppliger et al. 1999a). Die molekulare Ursache der Aktivit�tssteigerung
phosphorylierter PTPS gegen�ber dem nicht modifizierten Protein ist jedoch
noch nicht gekl�rt.
Durch anti-GTPCH und anti-PTPS Antik�rper konnten bei Ratten unter-
schiedliche Expressionsmuster in verschiedenen Geweben bzw. Zelltypen
mit genereller Colokalisation aromatischer Aminos�ure-Hydroxylasen nach-
gewiesen werden (Dassesse et al. 1997). Humane Makrophagen zeigen fast
keine PTPS-Aktivit�t, und in humanen Lymphozyten ist die Aktivit�t gering
(Schoedon et al. 1987). Im Gegensatz dazu weisen unreife Erythrozyten,
einschlie�lich Retikulozyten, eine h�here PTPS-Aktivit�t als differenzierte
Erythrozyten auf, welche wiederum keine GTPCH-Aktivit�t besitzen
(Shintaku et al. 1988).
3.2 Struktur der PTPS
Neuere Untersuchungen sowohl des humanen als auch des tierischen
Enzyms (Ratte) f�hrten zu einem besseren Verst�ndnis seiner Funktion und
erbrachten detaillierte Informationen �ber die Struktur auf molekularer Ebene
(B�rgisser et al. 1994; Nar et al. 1994; B�rgisser et al. 1995).
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Kapitel I – B : Biochemische Grundlagen des BH4-Stoffwechsels
12
Die S�ugetier-PTPS ist ein Homooligomer aus 6 identischen 16 kd Unterein-
heiten (B�rgisser et al. 1994) und ben�tigt die beiden Metalle Zn2+ und Mg2+
f�r ihre Aktivit�t, wobei Zn2+ einen essentiellen Bestandteil des jeweiligen
aktiven Zentrums ausmacht. Kristallstrukturanalysen von Ratten-PTPS be-
st�tigen die vermutete homohexamerische Struktur des Enzyms und zeigen
weiterhin, da� PTPS aus zwei Trimeren gebildet wird und in seiner Gesamt-
heit einem Durchmesser und einer H�he von 60 � aufweist (Oppliger et al.
1995b). Die folgenden Angaben zur Lokalisation der Aminos�uren beziehen
sich auf das Tierische Enzym (Ratte), welches dem humanen in seiner Ami-
nos�uresequenz sehr �hnlich ist (82% Sequenzidentit�t). Die Kristallisation
des humanen Enzyms ist bisher noch nicht gelungen, weshalb auch noch
kein humanes Strukturmodell verf�gbar ist.
Monomerstruktur: Eine Untereinheit besteht aus einer einzigen kompakten
Dom�ne und ist in eine α + β Struktur gefaltet, die aus einem vierstr�ngigen
antiparallelen β-Faltblatt besteht (Aminos�uren 10-23, 48-61, 128-132, 137-
141), auf dem einseitig ein Paar antiparalleler α-Helices aufgelagert ist (AS
72-88 und 106-120). Die beiden α-Helices sind zwischen den β-Str�ngen 2
und 3 inseriert und ihrerseits durch ein Segment verbunden, welches ein Tri-
peptid (89-91) mit β-Strang-Konformation beinhaltet. Dieses hat durch Was-
serstoffbr�cken Beziehung zu den Aminos�uren 20-24 von β-Strang 1 und
erweitert auf diese Weise die komplette β-Faltblattstruktur.
Zwischen den Str�ngen β-1 und β-2 befindet sich ein Fragment mit einer
L�nge von 24 Aminos�uren, welches seinerseits ein kurzes, zweifach gewik-
keltes α-helikales Segment (Aminos�urereste 32-39) beinhaltet, das unter-
halb der beiden gr��eren Helices auf der gleichen Seite des β-Faltblattes
liegt (Abb. 1.7).
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Kapitel I – B : Biochemische Grundlagen des BH4-Stoffwechsels
13
Die gesamte Dom�ne hat eine ellipsoide Form mit den Abmessungen 60 � x
24 � x 18 � (Auerbach; Nar 1997). Topologisch geh�rt sie zu einer Gruppe
von Strukturmotiven, die dadurch charakterisiert wird, da� eine Lage von
β-Str�ngen einer Lage α-Helices angelagert ist, welche beide einen hydro-
phoben Kern einschlie�en (Orengo; Thornton 1993).
Trimerstruktur: Drei Untereinheiten stehen wiederum durch eine dreigefal-
tete molekulare Symmetrieachse in Verbindung und sind durch Wasserstoff-
br�cken zwischen den N- und C-terminalen β-Str�ngen der benachbarten
Dom�nen zu einem Trimer zusammengesetzt, wodurch eine ungew�hnliche
zw�lfstr�ngige antiparallele β-Fa�struktur entsteht, die von einem Ring
α-Helices umgeben ist (Abb. 1.8).
Abb. 1.7: Schematische Darstellung (A) der Sekund�rstruktur des 6-PTPS Monomers mit Nume-
rierung der β-Str�nge und α-Helices und (B) der Terti�rstruktur (Peptidr�ckrad in Band-
Darstellung) des Monomers. Die Sekund�rstruktur repr�sentiert mit ihrer βαβααββ-Einheit in der
beschriebenen dreidimensionalen Anordnung ein neuartiges Strukturmotiv (Nar et al. 1994).
A
B
120
β4
C
β3
β2
β1
αC
αA
N
141
128
61
10
72
88
106
89
91
23
48
390
32
132
137
αB
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Kapitel I – B : Biochemische Grundlagen des BH4-Stoffwechsels
14
Das Trimer, welches eine diskoide Form aufweist, besitzt einen Durchmesser
von 60 � und eine H�he von 30 �. Die gebildete Fa�struktur hat eine leicht
konische Form mit einer engeren �ffnung auf der Seite, an der die Monomer-
enden lokalisiert sind und schlie�t eine hydrophile Pore von 6-12 � Durch-
messer ein, in welcher haupts�chlich basische und aromatische Aminos�u-
ren liegen.
Hexamerstruktur: Beide Trimere stehen �ber eine fast perfekte lokale zwei-
gefaltete Symmetrieachse, welche sich senkrecht zu der kristallographischen
Triade befindet, zueinander in Beziehung und bilden durch eine „Kopf an
Kopf“-Aneinanderlagerung den aktiven Enzymkomplex (B�rgisser et al. 1994;
Nar et al. 1994)(Abb. 1.9).
Die Kontaktregion beider H�lften wird durch den horizontalen Teil der β-Falt-
bl�tter zweier Monomere gebildet (Reste 20-24, 48-51, 89-91). Die β-Str�nge
zweier Untereinheiten laufen dabei fast senkrecht zueinander und sind weni-
ger als 4 � voneinander entfernt (Nar et al. 1994; Auerbach, Nar 1997).
Abb. 1.8: PTPS-Trimer mit Blickrichtung entlang der dreigefalteten Symmetrieachse. Die drei
vierstr�ngigen β-Faltbl�tter der Untereinheiten, welche farblich voneinander abgehoben sind, lagern
sich zu einem 12-str�ngigen antiparallelen β-Fa� zusammen, welches von einer Lage α-Helices um-
geben ist.
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Kapitel I – B : Biochemische Grundlagen des BH4-Stoffwechsels
15
Die hexamerische Anordnung wird durch heterologe rotationssymmetrische
Wasserstoffbr�cken zwischen den Untereinheiten A und B stabilisiert.
Die Gesamtabmessungen des PTPS-Hexamers betragen 60 � x 60 � x
60 �. Als Konsequenz aus der konischen Form des β-Fasses beider Trimere
schlie�t das Hexamer einen gro�en fl�ssigkeitsgef�llten Hohlraum mit den
Abmessungen 20 � x 20 � x 15 � ein, welcher nicht nur zu den Fa�enden
ge�ffnet ist, sondern auch �quatorial Verbindung zur Umgebung des Hexa-
mers hat.
�hnlich wie das PTPS-Hexamer bildet die GTPCH in der Quarti�rstruktur
(Decamer mit D5-Symmetrie) eine zentrale hydrophile Pore aus. Beide Poren
liegen wahrscheinlich w�hrend der BH4-Synthese aneinandergelagert und
dienen so der direkten Weiterleitung des Dihydroneopterin-triphosphats (Nar
et al. 1994). Der positiv geladene „Tunnel“ beider Enzyme w�rde auf diese
Weise die protonierte Form des Substrats stabilisieren, da die Halbwertszeit
der instabilen Zwischenstufe in Pufferl�sung nur sehr kurz ist (Milstien,
Kaufman 1985).
Abb. 1.9: Die Hexamerstruktur der PTPS mit Blickrichtung senkrecht zur β-Fa�struktur Das
aktive Enzym ist ein Dimer aus Trimeren mit 3D-Symmetrie. Die beiden Trimere (A+B) sind dabei
„Kopf an Kopf“-artig aneinandergelagert. Die Monomere jeden Trimers sind in unterschiedlichen Far-
ben dargestellt; die 7,8-Dihydroneopterin Substrate und das Zn2+-Ion sind rosa gekennzeichnet.
Trimer A
Trimer B
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Kapitel I – B : Biochemische Grundlagen des BH4-Stoffwechsels
16
Das aktive Zentrum: Das Homohexamer beinhaltet sechs katalytische Re-
gionen, welche am Ber�hrungspunkt der beiden Trimere (A+B) lokalisiert
sind. Drei Untereinheiten sind jeweils an einer katalytischen Region beteiligt,
welche wiederum von zwei Untereinheiten des einen Trimers (A und A`) und
einer Untereinheit des anderen Trimers (B) gebildet wird. Jede katalytische
Region besitzt eine Zn2+-Bindungsstelle, die im Zentrum einer 12 � tiefen
Vertiefung liegt. Das Zn2+-Ion wird vor�bergehend von N∈-Atomen der drei
Histidinreste HisA23, HisA48 und HisA50 gebunden. Als vierter Ligand bindet an
das Zn2+-Ion ein Wassermolek�l, welches im Komplex durch die C1` und C2`
Hydroxylgruppen der Dihydroneopterin-Seitenkette verdr�ngt wird. Dabei
entsteht eine pentavalente Koordination die f�r katalytische Zn2+-Ionen sehr
typisch ist (Ploom et al. 1999).
Weitere Liganden sind nicht vorhanden, was ein Hinweis darauf sein k�nnte,
da� das Substrat nur w�hrend der Katalyse von den freien Bindungsstellen
gebunden wird (Auerbach, Nar 1997).
Am Boden der Vertiefung befindet sich au�erdem ein durch die Aminos�ure-
reste ThrA105, ThrA106 und GluA107 gebildetes Strukturmotiv, welches der Purin-
Akzeptorstelle in G-Proteinen (Bourne et al. 1991) und der Pterin bindenden
Stelle der GTPCH (Nar et al. 1995), Sepiapterin-Reduktase (Auerbach et al.
1997) und der 7,8-Dihydroneopterin-Aldolase (Henning et al. 1998) �hnelt.
Wenn Dihydroneopterin-triphosphat in der entsprechenden Weise in dieser
Vertiefung plaziert wird, flankiert sein aromatisches Ringsystem zus�tzlich
die apolaren Aminos�urereste verschiedener Dom�nen (LeuA25, PheA39,
MetA`68, MetA`70 und LeuA`72).
Der Boden dieser Pterin bindenden Tasche besitzt ein stark negatives elek-
trostatisches Potential, welches die Bindung des Dihydroneopterins, das bei
physiologischem pH protoniert vorliegt, noch verst�rkt (Ploom et al. 1999).
Die Substrath�lfte, die durch das Enzym konvertiert wird, lagert sich in un-
mittelbarer N�he der Zn2+-bindenden Region und der Aminos�uren GluA133,
CysA42, AspB88 und HisB89 an. Die drei letztgenannten Aminos�uren formieren
einen neuartigen Typ einer katalytische Triade, die von verschiedenen Un-
tereinheiten gebildet wird (B�rgisser et al. 1995). Das nukleophile Cystein
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Kapitel I – B : Biochemische Grundlagen des BH4-Stoffwechsels
17
wird dabei durch die beiden anderen Aminos�urereste zur Protonenaufnah-
me aus der Substratseitenkette aktiviert und spielt somit eine zentrale Rolle
im aktiven Zentrum (Ploom et al. 1999).
Die sechs katalytischen Regionen des Enzyms befinden sich nahe der
�quatorialen �ffnungen zu dem fl�ssigkeitsgef�llten Hohlraum des Hexa-
mers. Der Abstand von einer Metallbindungsstelle des Monomers A betr�gt
16 � zu der entsprechenden Bindungsstelle des Monomers B.
Obwohl die Vertiefungen mit den katalytischen Regionen separiert voneinan-
der vorliegen, sind sie doch durch Wasserstoffbr�cken zwischen der Asn51-
Seitenkette einer Untereinheit und der His50-Seitenkette einer anderen Un-
tereinheit untereinander verbunden (Nar et al. 1994).
3.3 Struktur des PTS-Gens
Das menschliche PTS-Gen (Abb. 1.10+11), welches f�r das Monomer des
PTPS-Enzyms codiert, liegt auf dem Chromosom 11q22.3-q23.3, besteht aus
sechs Exons mit jeweils unterschiedlicher L�nge und umfa�t etwa 8kB (ac-
cession number der GenBank: L76259) (Th�ny et al. 1994b; Kluge et al.
1996a). Alle Exon/Intron-Grenzen stimmen mit der GT/AG-Regel (Shapiro,
Senapathy 1987) �berein. Das erste Exon beginnt mit dem Triplett ATG
(Startcodon) und Exon 6 endet mit dem Stopcodon TAG (Abb.1.11). Die bei
normalem Splei�en (Entfernung der Introns) des Prim�r-Transkripts (hnRNA)
entstehende mRNA codiert f�r ein 145 AS langes Polypeptid (PTPS-
Monomer), welches nach Zusammenschlu� mit f�nf weiteren Monomeren zu
einem Homohexamer das aktive Enzym bildet (B�rgisser et al. 1994; Nar et
al. 1994). Entsprechende cDNAs konnten aus allen untersuchten Zelltypen
oder Zellinien, einschlie�lich neuronalen Zellen, dargestellt werden (Kluge et
al.1996b).
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Kapitel I – B : Biochemische Grundlagen des BH4-Stoffwechsels
18
Gelegentlich tritt eine kleine Deletion auf (c.164-168del5bp), die in normalen
Fibroblasten, Hapatom-Zellinien, und neuronalen Zellen beobachtet wurde
und ein �berspringen des Exons 3 verursacht (Hsiao et al. 1996; Kluge et al.
1996b). Bemerkenswerterweise ist diese Deletion in dem menschlichen Re-
tropseudogen PTS-PI „konserviert“, welches 74% �hnlichkeit mit dem
3`-Ende der PTPS-cDNA besitzt und auf dem Chromosom 9p12-p13 lokali-
siert ist (Kluge et al. 1996a). Die 23 bp lange Deletion in Exon 3 f�hrt zu einer
Verschiebung des Leserasters und dem vorzeitigen Translationsabbruch. Ein
in einer solchen Weise stark verk�rztes PTPS Peptid-Fragment ist in vivo
v�llig inaktiv, wenn es exprimiert wurde (Oppliger et al. 1995b). Ob diese
„Splei�-Variante“ in irgendeiner Weise eine regulatorische Funktion besitzt,
ist zur Zeit noch nicht bekannt. Bisher ist die Lage der Promotor-Region und
des Transkriptions-Starts im humanen PTS-Gen nicht gekl�rt (Th�ny et al.
2000).
Abb. 1.10: Struktur des hu-
manen PTS-Gens.
In der oberen Bildh�lfte ist die
Lage des Gens auf Chromo-
som 11 dargestellt Die Gr��e
der sechs Exons ist durch K�-
sten gekennzeichnet.
Die codierenden Regionen sind
schwarz markiert. Bei humaner
PTPS-mRNA wurden bisher
drei unterschiedliche 3`-Enden
in der nicht translatierten Regi-
on beschrieben (gestrichelte
Linien) (Kluge et al. 1996a, b).
Exon 1
Exon 2
Exon 3
Exon 4
Exon 5
Exon 6
ATG
TAG
2017bp
1531bp
395bp
2480bp
1980bp
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Kapitel I – B : Biochemische Grundlagen des BH4-Stoffwechsels
19
-167 GCGAGAGACA CCCTTAACGT GCTCCCGAGG CCGGATTGCG CAGAGCGGAG CGAGACCGAC
-107 TTCCTAGGGG CGCGTCTGGC ACGCACTGGT CCACGCGCGG TGGGAGGAGG CACCGGCCGC
0-47 GCGGCGGGAG GAGGTGCCGG CCGAGCACCG CAGACAGCGC CGGGAAGATG AGCACGGAAG
0014 GTGGTGGCCG TCGCTGCCAG GCACAAGTGT CCCGCCGCAT CTCCTTCAGC GCGAGCCACC
0074 GATTGTACAG GTAGGGTGTG CACACAGGTA CAGCGGCGGG CGTGCTGACG TCGGGCCCGG
0134 GAGGGCGCGG GGGCTGCTGG GGCGACGCGC GCTGGTCGGC TTCGTGGGGC TTCGGACGGC
0194 CTCCAGCATC CTGATGGGGG CTGGAGTGTC CCAGCCTGGA GGGGTGGGGG AGCTTGATGG
--- 1680 Bp ---
1934 ACGTAAGTAA TAAAATCAAC ATGATTTCTG ACTCTCCCTT TGGTGAGCTA AAGTAATAAA
1994 TTGGGAAACT TTTCAAAGAT CAGTACAAAT AATAAATATA AGGAACAGAG AAGGGGGTTT
2054 GAATGTGATA CTTGTGTCAT GCTGACTTTT TTTTTTTTTT TGGTCAGTAA ATTTCTAAGT
2114 GATGAAGAAA ACTTGAAACT GTTTGGGAAA TGCAACAATC CAAATGGCCA TGGGCACAAT
2174 TATAAAGGTG AGAGAAAAAC TGATGACATT TCAGCCCTTC AATAAGGATG AAAGAGTATT
2234 CAGCAAATGT AGACATAAAG AATGGGAAAA CTTACGGACA CAGTGTGAAT GCTTTGAGCC
2294 TTGAATGAGA AATTAAATGG GAGTTCAGAA TGAAAGGATC TGTTGTCTTG GTTGGGTGTG
2354 TGTTAAGTTT TACCTTGCAA TGTCAACTCT TACAAACAGT CCAAAACAAT GAATGGTTTA
--- 1140 Bp ---
3554 ATAACAGATG TTTTGGGGTA AATATTTAAG TATAGCTTTT GGGGACAGAT CTAATAATTT
3614 ATGTTGCCAA CTTGTGCTTG TATGTTGCTA ACTTGTGCTT GGATGTTGAT CTGTTGAAAG
3674 TCATGCTGTT TTTTTTGTAT TTTGTTTTCT TTCCATAGTT GTGGTGACAG TACATGGAGA
3734 GGTATGTGCA GAAAATATTT GTGTGGTTTT TGCAGATTGC TGGGCTCTCT TTCAGCCAGT
3794 GTGGTGGATT CTGTGTTGAA AACTGTTCCA GTCAGTATTG CTTCATTGTT GGCCCTTGTA
3854 TATGTGTGTG TGGTGAGCTG CCGCCATTCC AGGCCTCTCC TCTACCAAAG TGTTGTCTTT
3914 AATATGCTGT ATGTGGACAG GTAGAAGGGC TATACAATGA AAAGGATGCT TGAAGTACAT
3974 GGTGCTTCCA TGCTGAGGTC AATGATTATC TCTGGGATGA AGGCAAATGT GCAAATGTGG
4034 GCACAGTCTC TGCACATTGT ACTGCCTTTA ATAATTTGCC AGCCGTTTAA TATGGAGAGC
4094 CTATCACAGT AATATTCACC TTTGTTTATT CTTTAGATTG ACCCTGCTAC GGGAATGGTT
4154 ATGAATCTGG CTGATCTCAA AAAATATATG GAGGTAATGG CATGTTGGGT GCTTATTATG
4214 TGCTATTCCC TAACTGTAAT ATTTGGTGGC CCCCTATCTA CCTCCCCAAC CAGTTATCTC
4274 CTAAGGTTCC ATGACTTTGT GAATAGAACT GGATGTGGGT GTTGGGGAAT AGTTGGAAGA
--- 2160 Bp ---
6494 TTATTTTACA ACTTGAAATT TTGTAAAGTT GCCTTGTAAG ACTCAAATCT AGTACTTACA
6554 AATATTTAGT TAGTGGCTAA GTGATAAGGT GAGGTTTAGA GGCATAAGTG GAACAATTTG
6614 GAATTTGAGT CGTAAATGGA GTCAATGATA TTTTCCCTTG GTTTTGTCTC TAGGAGGCGA
6674 TTATGCAGCC CCTTGATCAT AAGAATCTGG ATATGGATGT GCCATACTTT GCAGATGTGG
6734 TGAGGTGGGT GGCACTGTAT CTTGCCTTAT GTGGATTGTA AAACAAGAAT TGATTTGAAT
6794 ACTTTGATTG TTGTGTGATT TCTGAAGTTT TAATTTAATG AAATCTTTCG AAACTAGAAT
6854 TTCTATTTTC TGTAAATATT AAACATGAAA TTTTATTGTT TGCATTTTGA ATTTTTTTTG
6914 TTTTTGTTTT TTTTTCTTAT AGCACGACTG AAAATGTAGC TGTTTATATC TGGGACAACC
6974 TCCAGAAAGT TCTTCCTGTA GGAGTTCTTT ATAAAGTAAA AGTATACGAA ACTGACAATA
8134 ATATTGTGGT TTATAAAGGA GAATAGCTAT TGGGGTTAGC ATTGCACAAA GCCCAGTTTC
8194 TTTCTGTGTT TGAAAAAGAT TTTGATCCCC TTGGAATATT AAGAGGTCAA CACGTGATTG
8154 TTGTACGTAC ACATTGTGCT CTGGAGTGCC TATTTATTGA AATCATTGTA AGACCTGTTA
Exon 1
1
2
Exon 2
Exon 3
Exon 4
Exon 5
Exon 6
Abb. 1.11: Darstellung der genomischen Sequenz des humanen PTS-Gens. Die Numerierung der
Basen beginnt mit dem Startcodon (+1). Die sechs Exons sind grau unterlegt, das Startcodon mit Wel-
lenlinie unterstrichen und das Stopcodon dunkelgrau gekennzeichnet. Die Anlagerungssequenzen der
verwendeten Primer sind unterstrichen (Vorw�rtsprimer: punktiert; R�ckw�rtsprimer: gestrichelt). F�r
Exon 2 wurden zwei unterschiedliche Vorw�rtsprimer (1+2) verwendet (s. Methodik). Das vollst�ndige
Gen umfa�t 8984 Basenpaare (accession number der GenBank: L76259).
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Kapitel I – C : Klinische und molekulare Grundlagen des PTPS-Mangels
20
C. Klinische und molekulare Grundlagen des PTPS-Mangels
1. Hyperphenylalanin�mie durch BH4-Mangel
1.1 Allgemeine Aspekte und die unterschiedlichen Enzymdefekte
Die genetisch bedingte Hyperphenylalanin�mie (HPA) ist die h�ufigste St�-
rung des Aminos�urestoffwechsels (Inzidenz in Deutschland ca.1:6600) und
kann sowohl durch einen Defekt der Phenylalanin-Hydroxylase
(PAH)(McKusick, 1994; Scriver et al. 1995) als auch eine Inaktivit�t oder
Mangel des obligatorischen Cofaktors Tetrahydrobiopterin (BH4) ausgel�st
werden. Letzteres findet sich bei etwa 2% aller Patienten mit HPA (Blau et al.
1996a). Ein BH4-Mangel manifestiert sich in einer Hyperphenylalanin�mie,
welche nicht auf eine phenylalaninarme Di�t anspricht. Klinisch werden zwei
unterschiedlichen Formen unterschieden (Blau et al. 1996a). Die h�ufigere
Variante ist der schwere bzw. zentrale Typ, der mit verminderter Produktion
der monoaminen Neurotransmitter einhergeht, was anhand der Verringerung
der Katecholamine und Serotonin sowie ihrer Abbauprodukte Homovanillin-
s�ure und 5-Hydroxyindolacetat im Liquor me�bar ist. Eine seltene Variante
ist die partielle bzw. periphere Form mit verminderter BH4-Biosynthese, je-
doch normalen Neurotransmittermetaboliten im Liquor.
Ein BH4-Mangel wird durch Fehlen oder einen Defekt der an seiner Biosyn-
these und Regenerierung beteiligten Enzyme (Abb.1.5 und 1.6) hervorgeru-
fen. Am weitesten verbreitet ist unter diesen die Einschr�nkung der
PTPS-Aktivit�t (Blau et al. 1993; McKusick, 1994), die zu einer sehr hetero-
genen Variante der Erkrankung mit (i), schwerer bzw. zentraler (ii) milder
bzw. peripherer (atypisch) oder (iii) transienter Form f�hren kann (Dhondt,
1984; Blau et al. 1993). Urs�chlich hierf�r sind Mutationen im PTS-Gen,
welche autosomal rezessiv vererbt werden. Die molekulare Grundlage f�r die
gro�e Variabilit�t des Ph�notyps ist zur Zeit noch unklar (Th�ny und Blau
1997).
Page 28
Kapitel I – C : Klinische und molekulare Grundlagen des PTPS-Mangels
21
Die schwere bzw. zentrale Form ist �hnlich wie bei GTPCH-Mangel durch
einen Neurotransmitterdefizit im Liquor gekennzeichnet, wohingegen bei der
peripheren Form normale Konzentrationen der Neurotransmittermetaboliten
gemessen werden.
Bei einem Mangel an GTPCH, welcher nur sehr selten beobachtet wird (ca.
4% aller Patienten mit BH4-Mangel), liegen die gemessenen Konzentrationen
von Neopterin, Biopterin und der Neurotransmittermetaboliten deutlich unter
den Normwerten. Autosomal dominante Mutationen im GCH1-Gen, welches
f�r GTPCH codiert, sind oftmals Ursache der Dopa-responsiven Dystonie
(DRD) (Ichinose et al. 1994; Segawa, Nomura 1995), jedoch nur in 40-50%
der F�lle (Furukawa, Kish 1999).
Bei St�rungen der Dihydrobiopterin-Reduktase (DHPR), die zweith�ufigste
Ursache f�r BH4-Mangel, sind nur einige F�lle der atypisch milden Form be-
kannt.
Ein Mangel an PCD (Pterin-4α-Carbinolamin-Dehydratase) ist �hnlich wie ein
GTPCH-Mangel sehr selten und zeigt sich bei Neugeborenen mit unter-
schiedlich erh�hten Phe-Konzentrationen, welche vor�bergehend Werte bis
zu 2200 �mol/l erreichen k�nnen.
PTPS
58%
unklassifiziert
2%
SR
1%
PCD
5%
DHPR
30%
GTPCH
4%
Abb. 1.12: Prozentuale Verteilung der unterschiedlichen Enzymdefekte bei Patienten mit BH4-
Mangel. PCD: Pterin-4α-Carbinolamin-Dehydratase; DHPR: Dihydrobiopterin-Reduktase; SR: Se-
piapterin-Reduktase; die Daten stammen von weltweit insgesamt 435 Patienten die inzwischen in die
internationale BIODEF-Database aufgenommen wurden (Stand Sep. 2001).
Page 29
Kapitel I – C : Klinische und molekulare Grundlagen des PTPS-Mangels
22
Ein Defekt der Sepiapterin-Reduktase wurde bisher nur in drei F�llen nach-
gewiesen und ist mit einem Mangel der monoaminen Neurotransmitter und
progressiver psychomotorischer Retardierung verbunden. Es zeigen sich im
Urin jedoch normale Pterinwerte. Weiterhin wird bei diesen Patienten keine
Hyperphenylalanin�mie beobachtet, was sich dadurch erkl�ren lie�e, da� die
Sepiapterin-Reduktase in peripheren Geweben durch Aldose-Reduktase
(AR), Carbonyl-Reduktase (CR) und Dihydrofolat-Reduktase ersetzt werden
k�nnte (Bonaf� et al. 2001).
1.2 Klinik des PTPS-Mangels
Schwere zentrale Form: Der klinische Verlauf der Krankheit ist unbehandelt
bei Patienten mit schwerer (typischer) Form des PTPS-, DHPR- und GTPCH-
Mangels sehr �hnlich (Dhondt 1984). Die Symptome k�nnen sich bereits
w�hrend der ersten Lebenswochen manifestieren, werden jedoch meist erst
etwa im vierten Lebensmonat beobachtet (Blau et al. 1996a). In der Neuge-
borenenphase fallen allerdings hin und wieder ungew�hnliche Verhaltens-
weisen wie geringe Neigung zum Nuckeln, verminderte Spontanbewegungen
oder Schlaffheit auf (Dhondt 1993).
Die gemeinsamen Symptome sind progressive geistige und physische Re-
tardierung und trotz phenylalaninarmer Di�t, gekennzeichnet durch epilepti-
sche Anf�lle (Grand Mal, myoklonische Attacken), St�rungen von Tonus und
Haltung, von ausgepr�gter Hypotonie bis hin zu Opisthotonus und Spastizi-
t�t, Somnolenz, Bewegungsanomalien sowie infektionslose wiederkehrende
Hyperthermien, Hypersalivation und Schluckschwierigkeiten. Schwankungen
der Wachsamkeit und der neurologischen Symptome im Tagesverlauf wer-
den ebenfalls beschrieben. Eine Mikrozephalie wird regelm��ig bei DHPR-
(33%) und PTPS-Mangel (52%) beobachtet, wohingegen diesbez�glich
kaum Informationen �ber Patienten mit GTPCH-Defekten vorliegen.
H�ufig ist die Erkrankung durch eine parkinson�hnliche Symptomatik ge-
kennzeichnet (Dudešek et al. 2001), was auf einen Mangel von Dopamin in
den Basalganglien hinweist (Allen et al. 1990).
Page 30
Kapitel I – C : Klinische und molekulare Grundlagen des PTPS-Mangels
23
Nur bei wenigen Patienten mit PTPS-Mangel werden Dystonien beobachtet
(Tanaka et al. 1987; Fink et al. 1988). Symptome wie bei Dopa-responsiven
Dystonien (DRD; Segawa-Erkrankung), die man lange nur bei Patienten mit
GTPCH-Mangel beobachtete (Ichinose et al. 1994; Ichinose et al. 1995; Blau
et al. 1995), wurden jedoch bei einem erwachsenen Patienten mit PTPS-
Mangel beschrieben, der eine generalisierte Dystonie mit tageszeitlichen
Schwankungen der Symptome zeigte (Hanihhara et al. 1997).
Milde periphere Form: Die milde (atypische) Form der Erkrankung ist recht
selten und wird nur bei etwa 20% der Patienten mit PTPS-Mangel beobach-
tet. Die periphere Form ist durch normale Neurotransmitterspiegel im Liquor
und moderate oder transiente Hyperphenylalanin�mie gekennzeichnet (Nie-
derwieser et al. 1987). Eine neurologische Symptomatik wird bei diesen Pati-
enten in der Regel nicht beobachtet.
In einigen F�llen von PTPS-Mangel wurden jedoch neonatale Hypotonien
oder akute jedoch transiente Verhaltensanomalien, neurovegetative Zeichen
und Schlafschwierigkeiten beschrieben (Blau et al. 1996a).
2. Diagnosik
2.1 Phenylalaninmessung
Alle Neugeborenen unterliegen routinem��ig etwa am 4.-5. Lebenstag zum
Nachweis einer Phenylalaninerh�hung im Blut einem Neonatalscreening, bei
welchem die Plasma-Phenylalaninwerte mittels eines semiquantitativen Te-
stes, dem sogenannten Guthrie-Test, gemessen werden (Guthrie und Susie
1963). Ein positives Testergebnis wird in der Regel bei Phenylalaninkonzen-
trationen >240�mol/l erreicht. An den meisten Zentren ist die Methodik ge-
genw�rtig schon auf Tandem-Massenspektroskopie umgestellt worden, wo-
durch zus�tzliche St�rungen des Intermedi�rstoffwechsels erkannt werden
k�nnen (Zchocke, Hoffmann 1999).
Neben den Patienten mit klassischer PKU weisen auch solche mit BH4-
Mangel eine Erh�hung der Plasma-Phenylalaninkonzentration auf und wer-
Page 31
Kapitel I – C : Klinische und molekulare Grundlagen des PTPS-Mangels
24
den somit ebenfalls im Neugeborenenscreening erfa�t, was eine weitere
Untersuchung der Patienten zur genaueren Diagnose der Erkrankung not-
wendig macht. Bei der schweren zentralen Form des PTPS-Mangels beob-
achtet man eine deutliche Hyperphenylalanin�mie mit Phe-Konzentrationen
um 1200�mol/l wohingegen bei Patienten mit der peripheren Form die Hy-
perphenylalanin�mie mit medianen Konzentrationen um 500 �mol/l etwas
geringer ausf�llt (Blau et al. 1996a).
2.2 BH4-Belastungstest
Der BH4-Test erkennt eine fehlende Verf�gbarkeit des Cofaktors Tetrahydro-
biopterin und kann ggf. im Zusammenhang mit einer Phe-Belastung durch-
gef�hrt werden. Der Test zeigt einen BH4-Mangel durch Absinken der Plas-
ma-Phe-Konzentration nach BH4-Gabe an (Abb. 1.13) und sollte sich bei er-
h�hten Phe-Werten als erstes an die Phe-Messung anschlie�en. Dieser Test
erm�glicht somit eine differentialdiagnostische Abgrenzung von BH4-Mangel
gegen�ber einem PAH-Mangel und erlaubt in gewissen Grenzen eine Subty-
pendifferenzierung bei BH4-Mangel.
Kurz vor einer oralen Tetrahydrobiopterin-Gabe (Testdosis 20 mg/kg K�rper-
gewicht) und etwa 4-8 Stunden danach wird die Phenylalaninkonzentration
im Plasma gemessen. Bei einem BH4-Mangel ist ein deutliches Absinken des
0
500
1000
1500
2000
2500
0 h
4 h
8 h
PKU
PTPS
GTPCH
DHPR
0
200
400
600
800
1000
1200
0 h
3 h
7 h
11 h
BH4
20 mg/kg
Phe
100 mg/kg
BH4
20 mg/kg
A
B
Abb. 1.13: Typische Me�ergebnisse der Phe-Konzentrationen nach einem einfachen (A) und
einem kombinierten (B) BH4-Belastungstest bei Patienten mit Hyperphenylalanin�mie. Der Test
dient zur Differenzierung von PKU Patienten und solchen mit Defekten im BH4-Metabolismus (Ponzone
et al. 1993). Auf den Y-Achsen sind jeweils die Phenylalaninkonzentrationen (�mol/l) aufgetragen.
Page 32
Kapitel I – C : Klinische und molekulare Grundlagen des PTPS-Mangels
25
Phenylalanins unter den kritischen Bereich zu beobachten, was bei der
klassischen PKU nicht der Fall ist (Abb. 1.13). Es konnten jedoch k�rzlich
auch einige Patienten mit sogenannter BH4-sensitiver Phenylketonurie ohne
Cofaktormangel beobachtet werden, die ebenfalls nach BH4-Gabe ein Absin-
ken der Phe-Konzentration zeigten (Kure et al. 1999; Spaapen et al. 2000).
Die Kombination einer Phenylalaningabe (100 mg/kg KG) mit dem BH4-
Belastungstest ist besonders dann sinnvoll, wenn die initialen Phenylalanin-
werte f�r einen einfachen BH4-Belastungstest zu gering sind (<400�mol/l)
(Ponzone et al. 1993).
2.3 Messung der Pterine
Gleichzeitig sollte bei Vorliegen einer Hyperphenylalanin�mie (Phe>
180�mol/l) zur differentialdiagnostischen Abgrenzung einer klassischen PKU
gegen�ber einem BH4-Mangel eine Messung der Pterine erfolgen. Enzym-
defekte in der BH4-Biosynthese f�hren zu krankheitsspezifischen Erh�hun-
gen oder Erniedrigungen der Pterine Biopterin und Neopterin.
Die genannten Metabolite (beide Abbauprodukte der BH4-Synthese) k�nnen
sowohl im Urin als auch im Liquor gemessen werden und erm�glichen eine
Differenzierung der verschiedenen Subtypen des BH4-Mangels. Ein hoher
Gehalt an Neopterin und lediglich Spuren von Biopterin sind charakteristisch
f�r einen PTPS-Mangel (Niederwieser et al. 1986), wohingegen beispielswei-
se bei einem GTPCH-Mangel auch Neopterin stark erniedrigt ist (Dhondt et
al. 1990) (Abb. 1.15).
Durch den Mangel der 6-Pyruvoyl-Tetrahydropterin-Synthase wird 7,8-Dihydro-
neopterin-triphosphat nicht mehr, oder zumindest unzureichend zu 6-Pyruvoyl-
Tetrahydropterin konvertiert, was in einer Akkumulation von 7,8-Dihydro-
neopterin-triphosphat in den Geweben der betroffenen Patienten resultiert.
Diese Zwischenstufe wird dann durch Pyrophosphatase dephosphoryliert
und als Dihydroneopterin, sowie als dessen Oxidationsprodukt Neopterin
ausgeschieden (Abb. 1.14).
Page 33
Kapitel I – C : Klinische und molekulare Grundlagen des PTPS-Mangels
26
Als Folge findet man hohe Konzentrationen von Neopterin, Monapterin (Iso-
mer von Neopterin) und 3`Hydroxysepiapterin im Urin. Biopterin dagegen ist
bei Patienten mit PTPS-Mangel nur noch in Spuren nachweisbar.
Eine Analyse der Pterine sollte m�glichst vor Beginn einer phenylalaninar-
men Di�t erfolgen und wird in den meisten Labors mittels HPLC (high-
performance liquid chromatography) durchgef�hrt (Dhondt et al. 1981; Nie-
derwieser 1984).
Bei der schweren zentralen Form des PTPS-Mangels beobachtet man im
Vergleich zu den anderen Enzymdefekten die h�chsten Neopterinkonzentra-
tionen und die gr��te Differenz von Neopterin zu Biopterin (Abb. 1.15). Bei
der milden peripheren (atypischen) Form liegen die Neopterinkonzentratio-
nen sowohl im Urin als auch im Liquor beinahe ebenso hoch wie bei der
zentralen Variante, die Biopterinkonzentration ist jedoch etwas h�her, liegt
allerdings immer noch unter den Normalwerten.
7,8-Dihydroneopterin-triphosphat ↑
PTPS
BH4 ↓
Dihydroneopterin ↑
Neopterin/Monapterin ↑
Abb. 1.14: Pathologischer Pterin-Metabolismus bei PTPS-Mangel. ↑ : Erh�hung der Konzentration,
↓ :Erniedrigung der Konzentration; der Enzymdefekt ist durch den Querbalken dargestellt.
GTPCH
GTP
Biopterin ↓
Page 34
Kapitel I – C : Klinische und molekulare Grundlagen des PTPS-Mangels
27
2.4 Neurotransmittermetabolite
Das bedeutendste Unterscheidungskriterium zwischen der schweren zentra-
len und der milden peripheren Form ist jedoch die Konzentration der Neu-
rotransmittermetabolite Homovanillins�ure (HVA) und 5-Hydroxyindolacetat
(5HIA) im Liquor, die bei der zentralen Variante deutlich verringert sind, sich
jedoch beim peripheren Typ im normalen Bereich bewegen. Hierdurch wird
plausibel, da� die Kenntnis des genauen Typus der Erkrankung auch Kon-
sequenzen f�r die Behandlung mit Neurotransmittervorstufen hat.
2.5 Enzymaktivit�t
Ein zus�tzliches diagnostisches Kriterium stellt neben der Mutationsanalyse
letztlich der Nachweis der Enzymaktivit�t dar. Die Aktivit�t aller an der BH4-
Synthese und Regeneration beteiligten Enzyme kann in Lebergewebe,
Erythrozyten und Fibroblasten gemessen werden. Bei Verdacht auf Cofaktor-
mangel ist routinem��ig insbesondere die Messung der DHPR-Aktivit�t
(Guthrie-Karten) von Bedeutung, da sich durch die Kombination mit der
Pterin-Messung meist schon eine genaue Diagnose stellen l��t (Dhondt
1991). Es wurden inzwischen verschiedene Methoden zum Nachweis der
PTPS-Aktivit�t in der Leber (Yoshioka et al. 1984; Niederwieser et al. 1985;
Dhondt et al. 1985), sowie in Erythrozyten (Shintaku et al. 1988) entwickelt.
Abb. 1.15: Typische Me�werte der Pterine im Urin (mmol/mol Kreat) (A) und Neurotransmitter-
metabolite im Liquor (nmol/l) (B) bei Patienten mit unterschiedlichen Defekten im BH4-
Metabolismus. Neo: Neopterin; Bio: Biopterin; HVA: Homovanillins�ure; 5HIA: 5-Hydroxyindolacetat
(Blau et al. 1996a). Auf den Y-Achsen sind jeweils die Konzentrationen der Metabolite aufgetragen.
0
5
10
15
20
25
Neo
Bio
GTPCH
PTPS
DHPR
PCD
PKU
GTPCH
PTPS
DHPR
PCD
PKU
0
100
200
300
400
HVA
5HIA
GTPCH
PTPS
DHPR
PCD
PKU
B
A
mmol/mol
Kreat.
nmol/l
Page 35
Kapitel I – C : Klinische und molekulare Grundlagen des PTPS-Mangels
28
Gew�hnlich werden nur 5-10 mg Lebergewebe oder 100 �l Erythrozyten f�r
den Test ben�tigt, der auf der Messung von BH4 basiert, das in Anwesenheit
von NADPH, Magnesium und SR aus Dihydroneopterin (Substrat) gebildet
wird. Das in der Reaktion entstandene BH4 wird fluorometrisch mittels HPLC
als Biopterin gemessen.
Bei Patienten mit der zentralen Form des PTPS-Mangels besteht in der Le-
ber keine me�bare PTPS-Aktivit�t mehr, w�hrend in Erythrozyten 0-8% (in
Einzelfallen noch bis zu 20%) Restaktivit�t gefunden wird (Niederwieser,
Curtius 1987; Shintaku et al. 1988). Bei der milden peripheren Form wird in
Erythrozyten noch eine residuale Aktivit�t von 7-10% gemessen. Die PTPS-
Aktivit�t ist in jungen Erythrozyten im Vergleich zu �lteren Erythrozyten h�-
her. Ebenso zeigen die Erythrozyten von Feten eine deutlich h�here Aktivit�t
als die von Erwachsenen.
Bei obligat Heterozygoten konnten erythrozyt�re PTPS-Aktivit�ten von
8-31% des Normalen anstelle der H�lfte gemessen werden, allerdings zeigt
sich eine assoziierte verringerte Biopterinsynthese nur in etwa der H�lfte der
Patienten, was weniger ist, als man erwarten w�rde. Weil dieser Test nicht in
allen F�llen eindeutig zwischen Patienten und obligat Heterozygoten unter-
scheidet, wurde vorgeschlagen, die Me�ergebnisse der PTPS-Aktivit�t unter
Ber�cksichtigung der Pterinkonzentrationen zu bewerten (Scriver et al.
1987).
2.6 Pr�nataldiagnostik
Zur Pr�nataldiagnostik bei Familien mit erh�htem Risiko f�r BH4-Mangel
(Familienanamnese) werden �blicherweise die Pterinkonzentrationen in der
Amnionfl�ssigkeit gemessen (Blau et al. 1989). Die Messung der Enzymakti-
vit�t in kulturierten Amniozyten (Guzman, Blau 1992), fetalen Erythrozyten
oder Chorionvilli erg�nzt die Analyse der Pterine (Blau et al. 1994). Bei
Kenntnis der krankheitsausl�senden Mutationen k�nnen molekulargeneti-
sche Verfahren zur Mutationsanalyse verwendet werden (z.B. Restriktions-
enzyme).
Page 36
Kapitel I – C : Klinische und molekulare Grundlagen des PTPS-Mangels
29
2.7 Molekulargenetische Diagnostik
Zur Mutationsanalyse k�nnen unterschiedliche Verfahren herangezogen
werden. Als Untersuchungsmaterial kann genomische DNA oder cDNA , die
z.B. aus Blut, Fibroblasten oder Biopsien gewonnen wird, Verwendung fin-
den. Sind krankheitsausl�sende Mutationen in der Familie bekannt, k�nnen
die Proben ggf. mittels entsprechender Restriktionsenzyme untersucht wer-
den (s. Kap. II). Zum Screening neuer Mutationen eignen sich beispielsweise
DGGE (Denaturierungs-Gradienten-Gelelktrophorese), SSCP (single stran-
det conformation polymorphism) oder DNA-Sequenzierung des f�r das ent-
sprechende Enzym codierenden Gens (s. Kap. II). Die Sequenzierung hat
den Vorteil sehr hoher Spezifit�t und Sensitivit�t, ist jedoch recht kostenin-
tensiv. Die gewonnenen Kenntnisse der Mutationsanalysen k�nnten nicht nur
eine bessere Vorhersagbarkeit des klinischen Verlaufs erm�glichen, sondern
auch zur Entwicklung neuer Therapieans�tze wie beispielsweise Gentransfer
hilfreich sein (Th�ny et al. 1996).
3. Genetik des PTPS-Mangels
Basierend auf der humanen cDNA-Sequenz wurden Mutationsanalysen bei
Patienten durchgef�hrt, die an Hyperphenylalanin�mie aufgrund eines PTPS-
Mangels erkrankt waren (Ashida et al. 1994; Imamura et al. 1994, Th�ny et
al. 1994b ; Oppliger et al. 1995a+b). Dabei wurden, �ber die gesamte cDNA
verteilt, verschiedene funktionell relevante Mutationen gefunden, welche zu
Aminos�ure�nderungen, Leserasterverschiebungen sowie vorzeitigen Stop-
codons f�hrten. Im Gegensatz zu Mutationen des GCH1-Gens wurden bisher
f�r das PTS-Gen ausschlie�lich rezessiv erbliche Mutationen gefunden
(Th�ny et al. 1994a; Oppliger et al. 1995a) Obwohl inzwischen 33 unter-
schiedliche Mutationen gefunden wurden (Tab. 1.1)(Blau et al. 2000b;
Imamura et al. 1999; Liu et al. 1998), wurden nur wenige auf ihre Funktiona-
lit�t untersucht. Der Zusammenhang zwischen Mutation und Ph�notyp ist
gr��tenteils noch unklar (Blau et al. 2000b). In nur sehr wenigen F�llen lie-
Page 37
Kapitel I – C : Klinische und molekulare Grundlagen des PTPS-Mangels
30
gen Daten �ber Genotyp-Ph�notyp-Korrelation vor (Blau et al. 2000a;
Oppliger et al. 1997; Scherer-Oppliger er al. 1999b). Funktionelle Untersu-
chungen von rekombinanten mutierten Proteinen zeigten, da� einige Mis-
sense-Mutationen, die bei Patienten mit schwerem PTPS-Mangel gefunden
wurden, deutlich reduzierte Enzymaktivit�t zur Folge hatten. Mutationen wie
Nonsense-Mutationen gr��ere Deletionen und Leserasterverschiebungen,
die eine Verk�rzung des Proteins verursachen (IVS1-3c>g, IVS2-7t>a,
V57del, K120X) f�hren zu instabiler und enzymatisch v�llig inaktiver PTPS
(Th�ny; Blau 1997).
Mutation
(Trivialname)a
Lokalisation
im Gen
Nukleotid-
aberrationb
Aminos�ure-
aberrationc
H�ufigkeit der
Mutationd
Ph�notypen
S15_R16insR
Exon 1
c.45_46insCGC
Arg ins bei 16
1x comp. het.
HPA, schwer (zentral)
R16C
Exon 1
c.46C>T
Arg>Cys bei 16
1x comp. het.
HPA, peripher
R25G
Exon 1
c.73C>G
Arg>Gly bei 25
2x comp. het.
HPA, schwer / mild
R25Q
Exon 1
c.74G>A
Arg>Gln bei 25
2x homozygot
HPA, schwer (zentral)
L26F
Exon 1
c.78G>T
Leu>Thr bei 26
1x comp. het.
HPA, mild (atypisch)
IVS1-3c>g
Intron 1
c>g bei -3
del(Lys29-Ser32)
2x comp. het.
2x homozygot
HPA, schwer (zentral)
E35G
Exon 2
c.104A>G
Glu>Gly bei 35
1x comp. het.
HPA, schwer (zentral)
N36K
Exon 2
c.108C>G
Asn>Lys bei 36
2x comp. het.
HPA
K38X
Exon 2
c.116_119del
Lys>Stop bei 38
1x comp. het.
HPA, mild (atypisch)
N47D
Exon 2
c.139A>G
Asn>Asp bei 47
1x comp. het.
HPA, transient
N52S
Exon 2
c.155A>G
Asn>Ser bei 52
23x (comp. het. +
homozygot)
HPA, schwer (zentral)
IVS2-7t>a
Intron 2
t>a bei -7
Lys>Stop bei 54
1x comp. het.
HPA, schwer (zentral)
V56M
Exon 3
c.166G>A
Val>Met bei 56
3x comp. het.
HPA, schwer (zentral)
V56del
Exon 3
c.166_168del
del Val bei 56
1x comp. het.
HPA, schwer (zentral)
V57del
Exon 3
c.169_171del
del Val bei 57
2x comp. het.
HPA, schwer (zentral)
IVS3+1g>a
Intron 3
g>a bei +1
unklar
1x comp. het.
HPA, schwer (zentral)
T67M
Exon 4
c.200C>T
Thr>Met bei 67
3x comp. het.
1x homozygot
HPA, schwer (zentral)
V70D
Exon 4
c.209T>A
Val>Asp bei 70
1x comp. het.
HPA, schwer (zentral)
L76F
Exon 4
c.226C>T
Leu>Phe bei 76
1x comp. het.
HPA, schwer (zentral)
E81E
Exon 4
c.243G>A
Glu>Glu bei 81
2x homozygot
HPA, schwer (zentral)
Tab. 1.1: �bersicht der bisher im PTS-Gen gefundenen Mutationen (Fortsetzung auf nachfol-
gender Seite).
Page 38
Kapitel I – C : Klinische und molekulare Grundlagen des PTPS-Mangels
31
Mutation
(Trivialname)a
Lokalisation
im Gen
Nukleotid-
aberrationb
Aminos�ure-
aberrationc
H�ufigkeit der
Mutationd
Ph�notypen
P87S
Exon 5
c.259C>T
Pro>Ser bei 87
23x (comp. het. +
homozygot)
HPA, schwer (zentral)
P87L
Exon 5
c.260C>T
Pro>Leu bei 87
2x comp. het.
2x homozygot
HPA, schwer (zentral)
D96N
Exon 5
c.286G>A
Asp>Asn bei 96
7x (comp. het. +
homozygot)
HPA, schwer (zentral)
Y99C
Exon 5
c.296A>G
Tyr>Cys bei 99
1x hemizygot
HPA, zentral, isoliert
F100V
Exon 5
c.298T>G
Phe>Val bei 100
1x comp. het.
HPA, schwer (zentral)
T106M
Exon 6
c.317C>T
Thr>Met bei 106
2x comp. het.
1x homozygot
HPA, schwer (zentral)
I114V
Exon 6
c.340A>G
Ile>Val bei 114
2x homozygot
HPA, schwer (zentral)
D116G
Exon 6
c.347A>G
Asp>Gly bei 116
1x comp. het.
HPA, transient
K120X
Exon 6
c.361_374del
Lys>Stop bei 120
1x comp. het.
HPA, peripher
V124L
Exon 6
c.370G>T
Val>Leu bei 124
1x comp. het.
HPA, mild (atypisch)
K129E
Exon 6
c.385A>G
Lys>Gly bei 129
2x homozygot
HPA, peripher bis
zentral
D136G
Exon 6
c.407A>G
Asp>Gly bei 136
1x comp. het.
HPA, schwer (zentral)
D136V
Exon 6
c.407A>T
Asp>Val bei 136
1x comp. het.
6x homozygot
HPA, schwer (zentral)
Tab. 1.1: �bersicht der bisher im PTS-Gen gefundenen Mutationen (Fortsetzung). Die Daten
stammen aus der Database of BH4 causing Mutations (BIOMDB) (Blau et al. 2000b). a Nomenklatur
entsprechend den aktuellen Empfehlungen (Dunnen; Antonarakis 2000). b Die Numerierung der
Nukleotide ist in Gro�buchstaben angegeben, bezieht sich auf die cDNA-Sequenz (GenBank M97655)
und beginnt mit Adenosin des ATG-Start-Codons; Kleinbuchstaben beziehen sich auf die Intron-
Sequenz (positives Vorzeichen: 5`-Ende, negatives Vorzeichen: 3`-Ende). c Die Numerierung der
Aminos�uren bezieht sich auf die Triplets (beginnend mit Start-Codon). d comp. het. : compound
heterozygot
Es konnte in einigen F�llen gezeigt werden, da� die relative Enzymaktivit�t
(im Vergleich zum Wildtyp) mancher rekombinant in COS-1-Zellen und E. coli
exprimierter PTPS-Mutanten deutlich �ber der in prim�ren Fibroblasten ge-
messenen Enzymaktivit�t lag (s. Abb.1.16), was eine aktivit�tssteigernde
posttranslationale Modifikation der PTPS in eukaryontischen Zellen vermuten
l��t (Oppliger et al. 1995b).
Bei einem Patient (Mutation K129E homozygot) mit transienter HPA, entwik-
kelte sich der urspr�nglich periphere PTPS-Mangel mit zunehmenden Alter
zur zentralen Form der Erkrankung. In Fibroblasten und Erythrozyten des
Patienten war keine PTPS-Aktivit�t nachweisbar, das rekombinant in COS-1-
Zellen und humanen Hepatom-Zellen (Hep G2 Zellinie) exprimierte Protein
zeigte jedoch volle Enzymaktivit�t. Dies l��t vermuten, da� die Aktivit�t der
mutierten PTPS (K129E) zelltypabh�ngig ist (Oppliger et al. 1997).
Page 39
Kapitel I – C : Klinische und molekulare Grundlagen des PTPS-Mangels
32
Es konnte ein dominant negativer Effekt des Allels N47D nachgewiesen wer-
den, das bei einem Patienten mit transienter HPA compound heterozygot
gefunden wurde (Scherer-Oppliger et al. 1999b). Ein dominant negativer Ef-
fekt mancher Mutationen k�nnte auch f�r die niedrige erythrozyt�re PTPS-
Aktivit�t verantwortlich sein, wie sie zum Teil bei obligat Heterozygoten ge-
funden wird (Shintaku et al. 1988).
0
20
40
60
80
100
WT
R16C
R25Q
T67M
P87S
P87L
D96N K129E D136V
Fibroblasten
COS-1-Zellen
E. coli
A
ktivit�t (%
)
Abb. 1.16: Relative Enzymaktivit�ten unterschiedlicher PTPS-Mutanten in verschiedenen Zellen.
Die Aktivit�t wurde in prim�ren Fibroblasten gemessen (nur dargestellt, wenn homozygote Mutationen
vorlagen). Einige Mutanten wurden zudem rekombinant in COS-1-Zellen und E. coli exprimiert und
anschlie�end die Aktivit�t bestimmt. Die in vitro gemessene Aktivit�t war oftmals noch h�her als die in
COS-1-Zellen und E. coli bestimmte Aktivit�t (Daten nicht dargestellt) (Oppliger et al. 1995a; Oppliger
et al. 1997; Imamura et al. 1995; Liu & Hsiao 1996; Dudešek et al. 2001). Die in den unterschiedlichen
Zelltypen gemessenen Aktivit�ten sind in prozentualer Relation zu den jeweils beim Wildtyp (WT) ge-
messenen Aktivit�ten (als 100% definiert) dargestellt. ★ Die Aktivit�t der in COS-1-Zellen exprimierten
Mutante K129E betrug �ber 350% im Vergleich zum Wildtyp (Oppliger et al. 1997).
★
Page 40
Kapitel I – C : Klinische und molekulare Grundlagen des PTPS-Mangels
33
4. Therapie
W�hrend sich die Behandlung bei der klassischen Phenylketonurie (PAH-
Mangel) in erster Linie auf eine phenylalaninarme Di�t st�tzt, besteht die
Therapie bei BH4-Mangel wesentlich aus einer Tetrahydrobiopterin-
Substitution, welche in der Regel durch die Verabreichung von Neurotrans-
mittervorstufen erg�nzt wird (Kombinationstherapie).
Kontrolle des Blut-Phenylalanin-Spiegels: Obwohl Kinder mit BH4-Mangel
eine h�here Phenylalanin-Toleranz als Patienten mit klassischer PKU auf-
weisen, spielt die genaue Einstellung des Plasma-Phenylalaninspiegels eine
besondere Rolle. Erh�hte Plasma-Phe-Spiegel beeintr�chtigen den Mem-
brantransport der Neurotransmittervorstufen und bewirken eine kompetitive
Hemmung der Tyrosin- und Tryptophan-Hydroxylase (Ponzone et al. 1987).
Die genaue Kontrolle der Phenylalaninkonzentrationen ist daher von noch
gr��erer Bedeutung als bei Patienten mit PAH-Mangel. Manche Patienten
mit Neurotransmitter-Therapie zeigen schon neurologische Probleme, wenn
die Phenylalaninkonzentrationen 360 �mol/l �berschreiten (Blau et al. 1993).
BH4-Therapie: Bei Patienten mit GTPCH- oder PTPS-Mangel ist die Verab-
reichung von BH4 die effizienteste Ma�nahme zur Einstellung der Phe-
Konzenration. Relativ geringe Dosen von Tetrahydrobiopterin (1-5 mg/kg/T)
normalisieren bereits die Plasma-Phe-Konzentration und machen so die
Phenylalaninarme Di�t �berfl�ssig.
BH4 ist nicht ausreichend liquorg�ngig (Gal et al. 1976); auch wenn einzelne
F�lle mit g�nstigem Verlauf unter BH4-Monotherapie bekannt sind (Endres et
al. 1982a, Endres et al. 1982b, Leupold et al. 1982), ist diese in der Regel
nicht ausreichend, die charakteristischen neurologischen Folgen der Erkran-
kung auszuschlie�en. Zwar konnte gezeigt werden, da� me�bare Mengen
von peripher verabreichtem Tetrahydrobiopterin das Gehirn erreichen, wenn
gr��ere Dosen (5-20 mg/kg/T) gegeben werden (Ponzone et al. 1989; Ka-
patos, Kaufman 1981), doch erweist sich die BH4-Monotherapie in der Praxis
meist als unzureichend, um die normale Syntheserate der zerebralen Neu-
rotransmitter zu gew�hrleisten.
Page 41
Kapitel I – C : Klinische und molekulare Grundlagen des PTPS-Mangels
34
Neurotransmitterersatz: Eine Behandlung mit L-Dopa und 5-Hydroxy-
tryptophan (5-HT) in Erg�nzung zur BH4-Substitution ist die g�ngige Thera-
pie bei allen Subgruppen des BH4-Mangels. Die zus�tzliche Gabe von Carbi-
dopa, das die periphere aromatische Aminos�ure-Decarboxylase hemmt,
reduziert dabei die therapeutische Dosis von L-Dopa. Die verabreichte Dosis
von L-Dopa + 10% Carbidopa betr�gt initial 1-2 mg/kg/T, bei Kindern unter
zwei Jahren 5 und bei Kindern �ber zwei Jahren 8-10 mg/kg/T. 5-Hydroxy-
tryptophan wird in gleicher Dosierung verabreicht. Nur bei Kindern �ber zwei
Jahren f�llt sie mit 6-8 mg/kg/T etwas geringer aus.
Ein genaues Monitoring der Behandlung ist dabei von besonderer Bedeutung
und kann am exaktesten �ber die Konzentrationsmessung der Neurotrans-
mitter im Liquor erfolgen. Eine Einschr�nkung besteht darin, da� eine regel-
m��ige Liquorpunktion mit entsprechenden Risiken verbunden ist. Indirekt ist
jedoch ein Monitoring der Dopaminkonzentration im Hypothalamus �ber die
Messung der Prolaktin-Spiegel im Blut m�glich. Prolaktin dient als sehr sen-
sitiver Marker f�r die hypothalamische Dopaminkonzentration und kann somit
zur zus�tzlichen Kontrolle der Dopaminkonzentration gemessen werden
(Spada et al. 1996; Birnbacher et al. 1998). Allerdings spiegelt Prolaktin nicht
den Serotoninumsatz wider. Au�erdem wird von ausgepr�gten t�glichen
Schwankungen der Prolaktin-Plasmakonzentrationen berichtet, die durch
Stre�, Anstrengung und Nahrungseinfl�sse bedingt sein k�nnen.
Die optimale Dosierung der Neurotransmitter zur effektiven Behebung der
Kardinalsymptome sollte somit in erster Linie auf der Basis der klinischen
Symptomatik erfolgen (Dudešek et al. 2001). T�gliche Schwankungen wer-
den oft beobachtet und erfordern dann meist �nderungen im Therapieplan.
Auch wenn diese Therapie inzwischen recht verbreitet ist (Dudešek et al.
2001), k�nnen potentielle Risiken w�hrend der neonatalen Gehirnentwick-
lung noch nicht ausgeschlossen werden, da noch zu wenig Daten von Lang-
zeituntersuchungen bekannt sind und noch nicht endg�ltig gekl�rt ist, ob die
verabreichten Neurotransmittervorstufen oder Carbidopa wom�glich signifi-
kante Nebenwirkungen haben k�nnten.
Page 42
Kapitel I – C : Klinische und molekulare Grundlagen des PTPS-Mangels
35
5. Prognose
Es hat sich gezeigt, da� die BH4-Substitution in Kombination mit Neu-
rotransmitterersatz ein recht effizientes, aber immer noch nicht vollst�ndig
ausreichendes Therapeutikum darstellt. Die Behandlung f�hrt zwar meist zu
einer deutlichen Verbesserung der Symptomatik mit Verschwinden neurolo-
gischer Zeichen. Trotzdem werden regelm��ig Sprachst�rungen, Schlafpro-
bleme und eine verlangsamte Entwicklung beobachtet. Einige Patienten mit
PTPS-Mangel starben sogar, obwohl die Behandlung bereits in den ersten
Lebensmonaten begonnen wurde (Blau et al. 1993).
Auch wenn die Ursache des zeitweise unzureichenden Erfolges gelegentlich
im zu sp�ten Therapiebeginn zu suchen ist und Ergebnisse gr��erer Pati-
entengruppen mit sehr fr�hem Therapiebeginn positivere Ergebnisse erbrin-
gen, gibt es Gr�nde f�r einen limitierten Therapieerfolg:
-
Das Auftreten fetaler Gehirnsch�den ist wahrscheinlich, insbesondere bei
PTPS-Mangel, weil h�ufig verringertes Geburtsgewicht, klinische Zeichen
und Mikrozephalie schon bei der Geburt beobachtet werden.
-
M�gliche iatrogene Sch�den der Neurotransmittervorstufen oder Carbi-
dopa k�nnen noch nicht ausgeschlossen werden.
-
Weiterhin ist es wahrscheinlich, da� das Ansprechen auf die Therapie
von der Schwere des metabolischen Defektes abh�ngig ist, was sich im
gr��eren Therapieerfolg bei Patienten mit nahezu normalen HVA-
Konzentrationen im Liquor widerspiegelt (Giugliani et al. 1986).
-
BH4-Mangel f�hrt zu einer Dysfunktion der Stickoxidsynthase, wodurch es
zu einer erheblichen Produktion von Sauerstoffradikalen kommt. Hier-
durch k�nnte es zu einem Gewebeschaden kommen, der durch die g�n-
gige Therapie nicht zu behandeln ist.
Andererseits ist trotz der genannten Einschr�nkungen die bisherige Therapie
durch eine signifikante Verbesserung des Verlaufs und eine deutliche Verrin-
gerung der Letalit�t der Erkrankung gekennzeichnet. Die Verbesserung pr�-
nataler Diagnoseverfahren l��t in Zukunft wom�glich auch einen pr�natalen
Behandlungsbeginn denkbar werden.
Page 43
Kapitel I – D : Ziele der Untersuchung
36
D. Ziele der Untersuchung
Zur Zeit liegen noch unzureichende Informationen �ber die genetische
Grundlage vieler Defekte der 6-Pyruvoyl-Tetrahydropterin-Synthase (PTPS)
vor. Trotz umfangreicher klinischer und laborchemischer Daten (BIODEF-
Database) wurde ein Gro�teil der an PTPS-Mangel erkrankten Patienten
bisher noch nicht molekulargenetisch, auf Mutationen im PTS-Gen unter-
sucht. Auch herrscht immer noch Unklarheit �ber die Korrelation von Mutati-
on und Ph�notyp des klinischen Krankheitsbildes, ebenso wie die sehr unter-
schiedliche Auspr�gung der Symptomatik von einem besonders milden Ver-
lauf bis hin zu schwerer Erkrankung mit progressiven neurologischen St�-
rungen oder sogar letalem Ausgang.
Eine bessere Kenntnis der der Krankheit zugrundeliegenden genetischen
Defekte und deren Auswirkung auf die Enzymaktivit�t ist somit prognostisch
als auch therapeutisch von gro�er Bedeutung.
Im Rahmen der vorgelegten Dissertation wurde eine Sequenzanalyse des
PTS-Gens bei neun Patienten mit nachgewiesener signifikanter Reduktion
der PTPS-Aktivit�t durchgef�hrt. Ziel der Untersuchung war es, die f�r den
Enzymdefekt verantwortlichen Mutationen im PTS-Gen zu identifizieren und
einen Beitrag zum besseren Verst�ndnis der genetischen Zusammenh�nge
von Mutation und Ph�notyp zu leisten.
Page 44
Kapitel II – A : Methoden
37
KAPITEL II : METHODIK
A. Angewandte Methoden
1. Allgemeine Betrachtung
Es stehen inzwischen eine Vielzahl verschiedener Methoden zur Verf�gung,
um Mutationen in einem Gen zu identifizieren. Grunds�tzlich ist zwischen
Techniken zu unterscheiden, die auch unbekannte Mutationen ausfindig
machen k�nnen (z.B. Sequenzierung oder Denaturierungs-Gradienten-
Gelelektrophorese [DGGE]) und solchen, die lediglich die Erkennung bereits
bekannter Mutationen zulassen (z.B. Enzym-verdau oder Amplification
refractory mutation system [ARMS]). Zudem weisen alle Verfahren
unterschiedliche Sensitivit�t und Spezifit�t bei unterschiedlichem Kosten-
und Zeitaufwand auf, was entsprechende �berlegungen zur Wahl der
geeigneten Methoden erforderlich macht.
Die im Rahmen dieser Untersuchung zur Verf�gung stehenden Patienten
wiesen alle einen enzymatisch belegten Defekt der 6-Pyrovoyl-
Tetrahydropterin-Synthase auf. Die Art und Lokalisation der f�r den
jeweiligen Defekt verantwortlichen Mutationen war jedoch nicht bekannt.
Wegen der hohen Spezifit�t und Sensitivit�t der Methode und der relativ
geringen Gr��e des PTS-Gens fiel die Entscheidung auf eine vollst�ndige
Sequenzierung der genomischen DNA aller sechs Exons. Zus�tzlich wurden
auch �ber die Exongrenzen hinaus die angrenzenden Intronsequenzen
analysiert, um auch Splei�mutationen erfassen zu k�nnen. Um Fehler
auszuschlie�en, wurden alle Exons zweifach und in Vorw�rts- und
R�ckw�rtsrichtung sequenziert. Zus�tzlich wurde die in Exon 2 gefundene
Mutation E35G durch Enzymverdau verifiziert.
Page 45
Kapitel II – A : Methoden
38
Nachfolgend werden alle durchgef�hrten Methoden besprochen und z.T.
zus�tzliche Hintergr�nde erkl�rt. Die detaillierten Angaben zu verwendeten
Materialien und die umfassenden Protokolle mit allen wichtigen
Arbeitsschritten sind im anschlie�enden Abschnitt aufgef�hrt (Kap. II-B:
Material und Protokolle).
2. DNA-Extraktion
2.1 Aus peripheren Lymphozyten
Ven�se Blutproben werden in EDTA-R�hrchen gesammelt, bei 4�C gelagert
(sofern notwendig) und so schnell wie m�glich weiterverarbeitet, um den
Verlust an DNA-Ausbeute so gering wie m�glich zu halten. Die Zellen
werden, wie im Einzelnen in Teil B diese Kapitels unter 1.2 beschrieben, vom
Plasma getrennt, die Erythrozyten lysiert und die DNA-enthaltenden
Leukozyten durch Zentrifugation gesammelt. Die DNA-Extraktion erfolgt mit
dem BACC2 Extraktions-Kit (Amersham).
Anschlie�end wird die DNA in TE-Puffer suspendiert und bei –20�C gelagert.
2.2 Aus Guthrie-Karten
DNA f�r PCR-Analysen kann au�erdem aus getrockneten Blutstropfen oder
Guthrie-Karten extrahiert werden, selbst wenn diese schon �ber Jahre
gelagert wurden.
Wir machten die Erfahrung, da� diese Proben, auch wenn sie quantitativ
weniger DNA lieferten, ebenso gute Sequenzierergebnisse zulie�en wie
frisch extrahierte DNA aus Vollblut.
Die Blutstropfen sollten von ausreichender Gr��e und das Filterpapier gut
durchtr�nkt sein. Die Extraktion der DNA erfolgt wie unter 1.4 in Teil B dieses
Kapitels beschrieben.
Page 46
Kapitel II – A : Methoden
39
3. Die Polymerasekettenreaktion (PCR)
1984 ver�ffentlichte Kary Mullis eine neue Methode zur in vitro-Amplifizierung
von spezifischen Nucleins�ure-Fragmenten, die inzwischen zu einer der am
meisten verwendeten Standardmethoden in der Molekulargenetik avancierte,
da sie einfach und schnell anzuwenden ist, in vielen F�llen das Klonen von
Genen �berfl�ssig macht und au�erdem auch ohne die Verwendung vitaler
Zellen durchf�hrbar ist.
Bei dem urspr�nglichen Prinzip der Polymerasekettenreaktion (PCR =
polymerase chain reaction) wird zun�chst eine Trennung der komplemen-
t�ren DNA-Str�nge durch Denaturierung bei 90-95�C durchgef�hrt. Darauf
folgend wird das Gemisch auf etwa 50�C abgek�hlt und zwei aus ca. 15-25
Basen bestehende Oligonukleotide (Primer) zugesetzt, die jeweils der
Sequenz an den 5`-Enden der beiden Einzelstr�nge komplement�r sind.
Durch Zusatz einer DNA-Polymerase werden die beiden Einzelstr�nge zum
jeweiligen Doppelstrang komplementiert und die zwischen den Primern
gelegene Zielsequenz verdoppelt.
Anschlie�end wird der aus Denaturierung, Anlagerung der Primer und
Extension bestehende Reaktionszyklus 20-30 Mal wiederholt, woraus eine
exponentiellen Zunahme der amplifizierten DNA-Molek�le folgt. Bei 20
Reaktionszyklen ergibt sich so unter realistischen Bedingungen in der Praxis
eine 105-fache Amplifizierung der Zielsequenz.
Durch den Einsatz thermostabiler DNA-Polymerasen aus thermophilen
Bakterien (Kogan et al. 1987) wird die Zugabe von neuer Polymerase nach
jeder Denaturierung, welche zuvor eine Inaktivierung der Polymerasen zur
Folge hatte, �berfl�ssig. Das von uns verwendete Enzym stammt aus dem in
hei�en Quellen lebenden Organismus Thermus aquaticus und wird folglich
als Taq-Polymerase bezeichnet.
Durch diese entscheidende Verbesserung und den Einsatz von
automatisierten Thermocyclern, die die exakte Temperatursteuerung
Page 47
Kapitel II – A : Methoden
40
�bernehmen, ist es m�glich geworden, enorme Amplifizierung geringster
Mengen Zielsequenz in knapp zwei Stunden durchzuf�hren.
Die L�nge der hier verwendeten Primer betrug jeweils etwa 20 Basen
zuz�glich eines 18 Basen langen Schwanzes, der wiederum der Anlagerung
der Cycle-Sequencing-Primer diente (s.u.). Die resultierenden Produktl�ngen
sind in Tab. 2.1 aufgef�hrt.
Die Primer f�r alle sechs Exons des PTS-Gens wurden mit dem Oligo-
Programm (MedProbe) auf einem Macintosh-Computer entworfen, mit
Ausnahme der Primer f�r Exon 1, die der Literatur entnommen wurden (Liu
et al. 1998).
Synthetisiert wurden die Primer von der Firma GIBCO BRL.
Jede PCR lief auf dem Gene Amp
�
PCR System 9700 (PE). Das Protokoll ist
im Einzelnen in Teil B dieses Kapitels unter 3.2 beschrieben. Nach jeder
PCR wurden 5�l des PCR-Produktes durch Gelelektrophorese auf einem
Agarosegel dargestellt, um den Erfolg der Amplifikation zu �berpr�fen.
4. Enzymverdau zur Detektion von Mutationen
Bei Restriktionsendonukleasen handelt es sich um prokaryontische Phospho-
diesterasen, welche die Bindung zwischen bestimmten Nukleotiden innerhalb
der Nukleotidkette aufschneiden. Die Schnittstelle liegt dabei an Stellen mit
Rotationssymmetrie (Palindrome), und ist f�r jedes Restriktionsenzym
spezifisch. Wird die Basensequenz beispielsweise an einer Stelle durch eine
Mutation so ver�ndert, da� eine palindromische Sequenz entsteht, welche
durch ein Restriktionsenzym erkannt wird, so l��t sich durch eine Spaltung
des DNA-Stranges an dieser Stelle die entsprechende Mutation ausfindig
machen. Wir verwendeten diese Methode zum Nachweis der Mutation E35G
in Exon 2. Allerdings war es erforderlich, durch einen speziell hierf�r herge-
stellten Primer (2.3 Teil B diesen Kapitels) k�nstlich eine palindromische
Sequenz zu schaffen, welche durch die Mutation alleine nicht gegeben war
(s. Kap.III–B).
Page 48
Kapitel II – A : Methoden
41
5. Sequenzierung der PCR-Produkte
Zur Sequenzierung der genomischen DNA wurde eine Modifikation der von
Frederick Sanger entwickelten enzymatischen Kettenabbruchmethode
verwendet (Sanger et al.1977). Hierzu folgt nach Amplifizierung der DNA
mittels normaler PCR eine zus�tzliche Cycle-Sequencing-PCR. Der dazu
verwendete, am 5�-Ende fluoreszierend markierte Primer setzt am 3`-Ende
der PCR-Produkte an und entspricht der Sequenz eines zus�tzlichen
Schwanzes des Primers, der f�r die erste PCR eingesetzt wurde.
Die Analyse der Basensequenz wird dadurch m�glich, da� die PCR in vier
gleich gro�e Ans�tze aufgeteilt wird und zus�tzlich zu den Desoxyribo-
nukleosidtriphosphaten in jeden Ansatz eine geringe Menge des jeweiligen
2�,3�-Didesoxyribonukleosidtriphosphates gegeben wird. Wird dieses
Nukleotid anstelle des normalen Nukleotids in die wachsende Polynukleotid-
kette eingebaut, so wird das Kettenwachstum beendet, da keine freie 3�-OH-
Gruppe f�r die Polymerisierung mehr vorhanden ist. Es entstehen dadurch
also sequenzspezifische Kettenabbr�che. In dem Ansatz, in den beispiels-
weise zus�tzlich Didesoxy-ATP gegeben wurde, weist jeder Kettenabbruch
auf das Vorhandensein der Base Adenin an dieser Stelle der Sequenz hin.
Werden anschlie�end die vier Ans�tze nebeneinander auf ein hochauf-
l�sendes Polyacrylamid-Gel aufgetragen, so treten nach der Elektrophorese
die verschieden langen Fragmente in Form unterschiedlicher Banden auf,
aus denen sich die Sequenz der amplifizierten DNA ablesen l��t. Die
Banden k�nnen generell durch den Einsatz entweder fluoreszierend bzw.
radioaktiv markierter Primer oder Terminatoren sichtbar gemacht werden.
Bei der vorliegenden Arbeit wurde zur automatisierten DNA-Sequenzierung
der Sequenzierer ALFexpress (Pharmacia Biotech) verwendet. Die bei der
Cycle-Sequencing-PCR eingesetzten, mit Cy5 markierten Primer fluores-
zieren im Laserlicht und werden w�hrend der Elektrophorese von
Photometern w�hrend ihres „Vorbeiwanderns“ erfa�t und von der Software
aufgezeichnet.
Page 49
Kapitel II – A : Methoden
42
Durch den Einsatz der universellen, am 5�-Ende fluoreszierend markierten
Primer M13 und M13 reverse bei der Cycle-Sequencing-Reaktion wird eine
Markierung der Sequenzierprimer �berfl�ssig, wodurch Zeit und Kosten
eingespart werden, weil die universellen Primer f�r alle Exons einsetzbar
sind, sofern bei der ersten PCR Primer mit den entsprechenden Schw�nzen
am 5�-Ende benutzt wurden (M13, M13 reverse).
Das 5�-Ende von M13 entspricht dem jeweiligen Schwanz der Vorw�rts-
primer, von M13 reverse dem Schwanz der entsprechenden R�ckw�rts-
primer, welche bei der ersten PCR eingesetzt wurden.
Dieses Vorgehen erm�glicht die Sequenzierung beider gegenl�ufigen
komplement�ren DNA-Str�nge, was die Genauigkeit der Methode noch
erh�ht und die Fehlerwahrscheinlichkeit verringert. Das detaillierte Protokoll
zur Sequenzierung ist in Abschnitt B dieses Kapitels beschrieben.
6. R�umliche Darstellung der ver�nderten Proteine
Zur Visualisierung der Auswirkungen der Mutationen auf molekularer Ebene
wurde ein Molecular-Modeling auf der Basis der bereits bekannten Struktur
der PTPS der Ratte durchgef�hrt (Koordinatensatz: 1b66.pdb der RCSB
Protein Data Bank). Als Software zur Proteindarstellung diente der Swiss-
PdbViewer (v3.7 beta 2) (Guex, Peitsch 1997). Die Kalkulationen der
dreidimensionalen Molek�ldarstellungen konnten auf einem handels�blichen
WINTEL-PC durchgef�hrt werden.
Zur qualitativen Verbesserung der r�umlichen Darstellung wurden manche
vom Swiss-PdbViewer generierten Datens�tze anschlie�end noch mit dem
Programm POV-Ray (Version 3.1g) berechnet.
Page 50
Kapitel II – B : Materialien und Protokolle
43
B. Materialien und Protokolle
1. DNA-Extraktion
1.1 Materialien
BACC2 Extraktions-Kit (Amersham); 5M Natriumperchlorat (70%); Chloroform;
Ethanol absolut; Chelex-Resin (5%ige Suspension Chelex 100 Resin BT der
FA. Bio-Rad in H2O); TE-Puffer (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA pH 7,4)
1.2 DNA-Extraktion aus Vollblut
1. 5ml EDTA-Blut in einem 50ml Polypropylen R�hrchen (Greiner Labor-
technik) mit Reagenz A (Extraktions-Kit) auf 40 ml auff�llen und
anschlie�end f�r 4 Minuten gr�ndlich durchmischen.
2. 5 min bei 1300 g zentrifugieren.
3. Den �berstand verwerfen; das Pallet 2ml Reagenz B des Nucleon-
Extraktions-Kits resuspendieren, gr�ndlich mischen und in 5ml R�hrchen
�berf�hren.
4. 500�l 5M Natriumperchlorat-L�sung dazugeben und einige Sekunden
sch�tteln.
5. 2ml Chloroform dazugeben und 10 min mischen.
6. 2 min bei 800 g zentrifugieren.
7. Langsam 300�l Nucleon Resin dazupipettieren und 4 min bei 1400 g zen-
trifugieren.
8. Den �berstand vorsichtig abpipettieren und in ein neues 50ml R�hrchen
umf�llen.
9. Die DNA mit kaltem Ethanol absolut ausf�llen und mit einem d�nnen, �ber
der Bunsenbrennerflamme sterilisiertem Glasstab in ein weiteres R�hr-
chen zu 500�l TE-Puffer �berf�hren.
10. DNA-Stamml�sung bei –70�C lagern.
Page 51
Kapitel II – B : Materialien und Protokolle
44
1.3 Bestimmung der DNA-Konzentration und Reinheit
1. 10�l der DNA-Stamml�sung in 90�l destilliertem H2O aufl�sen (1:10).
2. Die optische Dichte (OD) bei 260nm bestimmen (Absorption mit der von
H2O als Standard vergleichen – Eine OD-Einheit entspricht einer DNA-
Konzentration von etwa 50�g/ml – Die Konzentration der DNA-Stamm-
l�sung (�g/ml) wird als OD260•10•50 berechnet).
3. Dann die OD bei einer Wellenl�nge von 280nm bestimmen und die Ratio
OD260:OD280 berechnen (Eine Ratio von <1,65 w�re Hinweis auf eine
Proteinkontamination und w�rde eine weitere Aufreinigung der Probe
erforderlich machen, was in unserem Fall nicht notwendig war).
4. Falls die Konzentration der DNA-Stamml�sung nicht etwa 500�g/ml
betr�gt, diese durch entsprechende Verd�nnung einstellen.
1.4 DNA-Extraktion aus Guthrie-Karten
1. 1ml steriles, destilliertes Wasser in ein 1,5ml Eppendorf-Cup f�llen und ein
3x3mm gro�es St�ck Papier aus dem getrocknetem Blutstropfen
ausstanzen, dazugeben und vortexen.
2. Bei Raumtemperatur 15-30 min inkubieren und gelegentlich vortexen.
3. F�r 2-3 min bei 10000-15000 g zentrifugieren.
4. Den �berstand vorsichtig entfernen und verwerfen, so da� nur das Pellet,
das Papierst�ck und 20-30�l der Fl�ssigkeit im Gef�� verbleiben.
5. Mit 5% Chelex zu einem Gesamtvolumen von 200�l auff�llen und f�r 15-
30 min im Wasserbad bei 56�C inkubieren.
6. Anschlie�end f�r 5-10 s bei max. St�rke vortexen.
7. In kochendem Wasser f�r weitere 8 min inkubieren.
8. Danach 5-10s bei max. St�rke vortexen und f�r 2-3 min bei 10000-15000g
zentrifugieren.
9. 20�l des �berstandes f�r PCR verwenden.
10. Den Rest der Probe tiefgek�hlt lagern. F�r eine erneute Nutzung die
Schritte 9. und 10. wiederholen.
Page 52
Kapitel II – B : Materialien und Protokolle
45
2. Primersequenzen
2.1 Primer f�r die Amplifikation der 6 PTS-Exons
Tab. 2.1: Darstellung der verwendeten Primer f�r alle sechs zu amplifizierenden Exons. F�r
Exon 2 wurden zwei unterschiedliche Primer verwendet, die sich an unterschiedliche Bereichen am
5�-Ende der Sequenz anlagern und somit zu unterschiedlichen Produktl�ngen f�hren. Dies war
erforderlich, um den Bereich hinter der Poly-T-Sequenz auch in Vorw�rtsrichtung sequenzieren zu
k�nnen (s. Kap. III-B, Abb. 3.6). Der unterstrichene Teil der Sequenz dient jeweils der Anlagerung der
unten aufgef�hrten Cycle-Sequencing-Primer. F: Vorw�rtsprimer; R: R�ckw�rtsprimer. Weiterhin ist die
spezifische Anlagerungstemperatur und jeweils resultierende Produktl�nge angegeben.
2.2 Die markierten Universalprimer f�r die Cycle-Sequencing-Reaktion
M13 vorw�rts
5` ✶-TGTAAAACGACGGCCAGT
M13 r�ckw�rts
5` ✶-CAGGAAACAGCTATGACC
2.3 Modifizierter R�ckw�rtsprimer f�r den Enzymverdau in Exon 2
5` TCCCAAACAGTTTCAAGGTT 3`
(Als Vorw�rtsprimer fand der erste in der oben aufgef�hrten Tabelle angegebene Primer f�r Exon 2 (F)
Verwendung)
Primer (5`-3`)
Annealing-
temp.
Produkt-
l�nge
Exon 1
F
R
TGTAAAACGACGGCCAGTAGCACCGCAGACAGCGCCGGGAA
CAGGAAACAGCTATGACCATCAGGATGCTGGAGGCCGTCCGA
57�C
268 bp
Exon 2
F
F2
R
TGTAAAACGACGGCCAGTGAGAAGGGGGTTTGAATGT
TGTAAAACGACGGCCAGTTTTTGGTCAGTAAATTTCTAAG
CAGGAAACAGCTATGACCCACCCAACCAAGACAACAG
55�C
347 bp
297 bp (F2)
Exon 3
F
R
TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTTTGGGGACAGAT
CAGGAAACAGCTATGACCAACACAGAATCCACCACACT
55�C
258 bp
Exon 4
F
R
TGTAAAACGACGGCCAGTCCGTTTAATATGGAGAGCCTAT
CAGGAAACAGCTATGACCATAACTGGTTGGGGAGGTAGATA
55�C
231 bp
Exon 5
F
R
TGTAAAACGACGGCCAGTGGCTAAGTGATAAGGTGAGGTT
CAGGAAACAGCTATGACCTTACAATCCACATAAGGCAAGAT
55�C
243 bp
Exon 6
F
R
TGTAAAACGACGGCCAGTACTGTATCTTGCCTTATGT
CAGGAAACAGCTATGACCATGCTAACCCCAATAG
55�C
372 bp
Page 53
Kapitel II – B : Materialien und Protokolle
46
3. Die Polymerasekettenreaktion (PCR)
3.1 PCR-Reagenzien
Die Primer wurden von der Firma GibcoBRL synthetisiert und in Form
getrockneter Pellets geliefert. Diese waren entsprechend ihrer Konzentration
in TE-Puffer zu verd�nnen, um eine 100�M Stamml�sung herzustellen. Die
Stamml�sung wird 1:40 in H2O verd�nnt, um eine 2,5 �M Gebrauchsl�sung
zu erstellen.
Im einzelnen wurden verwendet:
Platinum™ Taq DNA Polymerase (5 U/�l), 10X PCR-Puffer und MgCl2
(50mM) waren als Set bei der Firma GibcoBRL erh�ltlich.
1,2mM dNTP-L�sung (10X Konzentration) wurde durch Verd�nnung von
60�l dNTP (jedes Nukleotid 20 mM, Pharmacia) in 940�l H2O hergestellt.
Dimethyl Sulfoxid (≥99,9%) war bei der Firma SIGMA erh�ltlich.
Die DNA-Stamml�sung (500�g/ml) wird 1:20 verd�nnt, um eine Gebrauchs-
l�sung mit der Konzentration von 25 �g/ml zu erhalten.
3.2 PCR Ansatz und Konditionen
Alle Proben liefen auf dem Gene Amp
PCR System 9700 (PE) mit
maximaler Aufheizgeschwindigkeit (Ramp Speed).
Es wurde jeweils mit 50�l Ans�tzen gearbeitet, die sich wie unten
beschrieben zusammensetzten.
Verwendung fanden dabei 200�l PCR-Softtubes der Firma Biozym.
Page 54
Kapitel II – B : Materialien und Protokolle
47
Ansatz Pro Cup (50�l):
Komponenten
Volumen
Endkonzentration
10X PCR-Puffer
5 �l
1X
50mM MgCl2
1,5 �l
1,5 mM
1,2 mM dNTP
5 �l
120 �M ( je dNTP)
Primer-Mix (je 2,5 �M)
5 �l ( je Primer)
250 nM
Platinum Taq Polymerase
0,2 �l
1 Unit
DMSO (≥ 99,9%)
2,5 �l
5%
dest. H2O
21 �l
DNA Template
5�l
125 ng
PCR-Zyklen:
Denaturierung
4 min. bei 95�C
30 sek. bei 95�C
30 Zyklen
45 sek. bei Annealingtemp.★
1 min. bei 72�C
Abschlie�ende Extension
5 min. bei 72�C
Abk�hlung
auf 4�C
★ Die jeweilige exonabh�ngige Anlagerungstemperatur (Annealingtemp.) ist
der Tabelle der verwendeten Primer zu entnehmen (Tab. 2.1).
Die PCR-Produkte anschlie�end bei 4�C oder -20�C lagern.
Page 55
Kapitel II – B : Materialien und Protokolle
48
4. Enzymverdau
4.1 Materialien
Restriktionsenzym (NlaIV) und der dazugeh�rige Puffer Y+/Tango™ (33 mM
Tris-Acetat, 10mM Magnesiumacetat, 66 mM Kaliumacetat, 0,1 mg/ml BSA)
sind als Set bei der Firma MBI Fermentas erh�ltlich.
4.2 Methode
Die PCR lief bei den unter 3.2 genannten Konditionen, jedoch gem��
Protokoll mit erh�hter MgCl-Konzentration (2.25 mM).
Als Vorw�rtsprimer dient der unter 2.1 aufgef�hrte Vorw�rtsprimer f�r
Exon 2 (F) und als R�ckw�rtsprimer der unter 2.3 aufgef�hrte speziell f�r
diesen Zweck modifizierte Primer. Das PCR-Produkt wird wie unten
beschrieben mit der Restriktionsendonuklease NlaIV verdaut.
1. 15�l Ansatz: 1,5�l Puffer
8,5�l H2O
0,25�l Restriktionsenzym (2,5 Units)
5�l DNA (PCR-Produkt)
2. Inkubation der Proben im Wasserbad bei der enzymspezifischen Tem-
peratur (37�C) f�r mindestens 4 Stunden.
3. Auftragen der verdauten Proben auf ein Agarose-Gel f�r die Gelelektro-
phorese (siehe unten).
Page 56
Kapitel II – B : Materialien und Protokolle
49
5. Agarose Gelelektrophorese der PCR-Produkte
5.1 Materialien
Loading-Puffer (5X): 30% Glycerin, 5% SDS, 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA,
0,1% BPB (3ml Glycerin, 0,5ml SDS, 10mg Tris-HCl, 4mg EDTA, 10mg BPB,
H2O ad 10ml).
Gr��enstandart (1kB Leiter): Gemisch aus 15�l der 1kB-Leiter (Pharmacia),
25 �l Loading-Puffer und 60 �l H2O.
Ethidiumbromid-Stamml�sung: 0,5 mg/ml in dest. H2O.
5.2 Methode
1. F�r mittelgro�e Gele 3g SEAKEM
� Agarose (FMC), NuSieve� Agarose
(FMC) oder ein Gemisch beider zu 150 ml 1X TBE-Puffer (Bio Whittaker)
geben. Anschlie�end gr�ndlich mischen und in der Mikrowelle so lange
erhitzen, bis die Agarose vollst�ndig aufgel�st ist.
2. Die L�sung auf etwa 50�C abk�hlen lassen, 75�l (0,5�l pro ml Gel)
Ethidiumbromid-Stamml�sung dazugeben und gr�ndlich mischen
3. Die Agarose in eine Gelform gie�en, den Kamm inserieren und das Gel
auf Raumtemperatur abk�hlen lassen. Anschlie�end Kamm entfernen.
4. 5�l des PCR-Produkts oder des Enzymverdau-Reaktionsgemisches mit
2�l Loading-Puffer mischen und in die Taschen des Gels pipettieren. Die
1kB-Leiter als Standard in die anliegenden Taschen pipettieren.
5. Elektrophorese bei 5-10 V/cm (normalerweise 100 V) f�r eine ange-
messene Zeit laufen lassen.
6. Nach der Elektrophorese k�nnen die Banden unter UV-Licht sichtbar
gemacht werden.
Page 57
Kapitel II – B : Materialien und Protokolle
50
6. Sequenzierung der DNA
6.1 Materialien
Thermo Sequenase™ fluorescent labelled Primer Kit (Amersham LIVE
SCIENCE) enth�lt A- , C- , G- , T- Reagenz (dNTP`s, das entsprechende
ddNTP, Magnesiumchlorid, Tween™ 20, Nonidet™ P-40, 2-Mercapto-
ethanol, thermostabile Pyrophosphatase und Thermo Sequenase DNA-
Polymerase) und Formamid Loading-Dye (Formamid, EDTA und Methyl-
violet).
Sequagel-6 der Firma National Diagnostics umfa�t Monomerl�sung
(5,7% Acrylamid, 0,3% Methylen-Bisacrylamid und Harnstoff in 0,1M Tris-
Borat und 2 mM EDTA-Puffer, pH 8,3) und Pufferl�sung (5X TBE-Puffer und
Katalysator in deionisiertem dest. H2O).
Ammoniumpersulfat (98%) von der Firma Sigma, 1X TBE-Puffer (0,1 M Tris-
Borat und 2mM EDTA, pH 8,3)
6.2 Cycle-Sequencing
1. Das gew�nschte Exon, wie oben beschrieben, mittels PCR amplifizieren
und 5�l des PCR-Produktes zur Kontrolle auf einem Agarose-Gel laufen
lassen. Das Produkt nur dann sequenzieren, wenn eine einzelne starke
Bande sichtbar ist.
2. Das PCR-Produkt durch zentrifugieren �ber QIUAquick-spin (Qiagen)
Reinigungss�ulchen den Herstellerangaben entsprechend aufreinigen.
3. F�r jedes zu amplifizierendes Exon zwei Ans�tze erstellen (je einer pro
DNA-Strang).
Von jedem Ansatz je 6�l in vier 200�l PCR-Softtubes pipettieren (jedes
enth�lt 2 �l des entsprechenden A-; C-; G-, oder T-Reagenzes)
(s. Abb. 2.1).
Page 58
Kapitel II – B : Materialien und Protokolle
51
Abb. 2.1: Vorbereitung der Ans�tze mit den vier unterschiedlichen Didesoxynucleosid-triphos-
phat-Reagenzien f�r das Cycle-Sequencing. In jedem R�hrchen (200�l PCR-Softtubes) befinden
sich letztlich 8�l Cycle-Sequencing-Gemisch.
4. Die Cycle-Sequencing-PCR bei folgenden Konditionen auf dem Thermo-
Cycler (Gene Amp
PCR System PE 9700) mit maximaler Ramp Speed
laufen lassen:
Denaturierung
2 min. bei 95�C
30 sek. bei 95�C
25 Zyklen
30 sek. bei 68�C
1 min. bei 72�C
Abschlie�ende Extension
5 min. bei 72�C
Abk�hlung
auf 4�C
5. Anschlie�end 2�l Formamid Loading-Dye zu den PCR-Produkten
dazupipettieren und m�glichst bald zum Sequenzieren auf das
Polyacrylamid-Gel auftragen.
20,7 �l H2O
2.2 �l fluoreszierend markierten Primer
(M13 oder M13 reverse)
3,5 �l PCR-Produkt
Je 6 �l
2�l
Reagenz A
2�l
Reagenz C
2�l
Reagenz G
2�l
Reagenz T
Ansatz (500 �l PCR-Tube):
Page 59
Kapitel II – B : Materialien und Protokolle
52
6.3 Herstellung des Polyacrylamid-Gels
1. Die Glasplatten gr�ndlich mit nichtfluoreszierendem Detergenz (Alconox,
Aldrich) reinigen, mit destilliertem Wasser und Ethanol absolut absp�len
und trocknen lassen.
2. Die Deckplatte unter Verwendung der 0,5mm Spacer auf der Basis
positionieren und mit Halteklammern arretieren. Den Kamm etwa bis zur
H�lfte am oberen Ende der Apparatur zwischen die Platten schieben.
3. 40ml Monomerl�sung und 10ml Pufferl�sung (SequaGel-6) in einen
dickwandigen Erlenmeyerkolben f�llen und unter R�hren f�r 2-5 min
entgasen.
4. 400�l frisch angesetzter 10%iger Ammoniumpersulfat L�sung zugeben
und behutsam mischen.
5. Die L�sung vom unteren Rand her mit einer Spritze vorsichtig zwischen
die Platten f�llen und dabei die Entstehung von Luftblasen vermeiden.
6. Den Kamm nun vollst�ndig einf�hren, mit Klammern fixieren und das Gel
f�r etwa zwei Stunden polymerisieren lassen.
6.4 Sequenzierungs-Elektrophorese
1. Das Gel in den Sequenzierer (ALFexpress, Pharmacia Biotech) h�ngen,
die Beh�lter am oberen und unteren Ende des Gels bis zur Markierung
mit 1X TBE-Puffer f�llen und behutsam den Kamm entfernen.
2. Die Taschen mit Puffer sp�len, die Intensit�t des Lasers �berpr�fen und
das Ger�t f�r 15-30 min bei 34 W laufen lassen.
3. Gegebenenfalls die Proben in der Zwischenzeit durch zweimin�tiges
Erhitzen auf 90�C denaturieren und auf Eis stellen.
4. Die Taschen des Gels erneut mit Puffer sp�len und die Proben in die
numerierten Taschen pipettieren (die Temperatur des Gels sollte etwa
50�C betragen).
Page 60
Kapitel II – B : Materialien und Protokolle
53
5. Nach �berpr�fung der Elektroden und der Laserintensit�t das Gel f�r 8-
12 Stunden bei 34 W laufen lassen.
6. Anschlie�end die vom Ger�t detektierten Banden mit Hilfe der Software
(AM V3.02 auf dem OS/2 System) am Computer auswerten:
Aus der Reihenfolge der Banden (Peaks), die die Basen Adenin, Cytosin,
Guanin, Thymin repr�sentieren, l��t sich die Sequenz des Gens
erstellen.
Page 61
Kapitel II – C : Patientendaten
54
C. Patientendaten
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden Proben von insgesamt neun Pa-
tienten mit enzymatisch nachgewiesenem Defekt der 6-Pyruvoyl-Tetra-
hydropterin-Synthase auf Mutationen im PTS-Gen untersucht.
Die Patienten stammen aus Deutschland und England und sind unterschied-
licher ethnischer Herkunft.
Die detaillierten Patientendaten, laborchemischen Parameter, gemessenen
Enzymaktivit�ten und klinische Befunde sind, soweit sie verf�gbar waren, in
den folgenden Tabellen dargestellt (Tab. 2.2-2.4). Im Anschlu� sind zum
Vergleich die entsprechenden Normwerte der angegebenen Parameter auf-
gef�hrt (Tab. 2.5).
Pat. Geschl.
Land
ethn. Herk.
Enzymaktivit�t
Form der
Erkrankung
01
m.
GB
arabisch
Enzymdefekt *
zentral
02
w.
D
kaukasisch
2,3�U/g Hb (13%)
zentral
03
w.
D
t�rkisch
0,78 �U/g Hb (4,4%)
zentral
04
m.
D
kaukasisch
0,11 �U/g Hb (0,6%)
peripher
05
m.
D
kaukasisch
0,42 �U/g Hb (2,4%)
zentral
06
m.
GB
indisch
2,9 �U/g Hb (16%)
transient
07
w.
D
t�rkisch
0 �U/g Hb (6 J.)
2,97 �U/g Hb (7 J.)
zentral
08
w.
GB
pakistanisch
0 �U/g Hb
zentral
09
m.
D
kaukasisch
Enzymdefekt *
zentral
Tab. 2.2: Auflistung der einzelnen Daten der untersuchten Patientenproben. In der rechten Seite
der Tabelle sind die gemessenen Enzymaktivit�ten sowie die Unterform der Erkrankung aufgef�hrt.
Die Enzymaktivit�t wurde in Erythrozyten (�U/g Hb) gemessen. * Es liegt kein genauer Wert f�r die
Enzymaktivit�t vor, lediglich ein Defekt ist enzymatisch verifiziert worden.
Bei einigen Patienten standen leider nur begrenzt oder auch keine Angaben
mehr zur Klinik oder laborchemischen Parametern zur Verf�gung. Ein En-
zymdefekt ist aber in allen F�llen nachgewiesen worden, wenn auch in zwei
F�llen keine genauen Werte f�r die Enzymaktivit�t vorliegen.
Page 62
Kapitel II – C : Patientendaten
55
Pat.
Neo (U)
mmol/mol Kr.
Bio (U)
mmol/mol Kr.
Neo (L)
nmol/l
Bio (L)
nmol/l
01
�
�
�
�
02
22,9 (2 Wo.)
3,0 (4 J.)
0,2 (2 Wo.)
1,1 (4 J.)
103 (2 Wo.)
169 (10 J. 6 Mo.)
69 (10 J. 7 Mo.)
70 (11 J. 9 Mo.)
63 (2 Wo.)
23 (10 J. 6 Mo.)
8,7 (10 J. 7 Mo.)
7 (11 J. 9 Mo.)
03
8,29 (7 J.)
0,26 (7 J.)
71,2 (7 J.)
163 (7 J. 1 Mo.)
40 (17 J. 9 Mo.)
57 (19 J.)
9 (7 J.)
10,4 (7J. 1 Mo.)
2,4 (17 J. 9 Mo.)
3,5 (19 J.)
04
18,1 (2 Wo.)
1,85 (13 J.)
0,2 (2 Wo.)
0,35 (13 J.)
96,0 (3 Wo.)
87,0 (7 Mo.)
56,0 (3 Wo.)
15,0 (7 Mo.)
05
43,4 (6 Mo.)
16,1 (14 J.)
0,52 (6 Mo.)
0,13 (14 J.)
115 (14 J.)
154 (15 J. 7 Mo.)
59,7 (15 J. 8 Mo.)
97 (16 J.)
19 (14 J.)
14 (15 J. 7 Mo.)
5,3 (15 J. 8 Mo.)
6,9 (16 J.)
06
23,0 (19 Tage.)
0,5 (19 Tage.)
122 (1 Mo.)
219 (1Mo. 2 Wo.)
236 (1 Mo. 3 Wo.)
56 (5 Mo. 2 Wo.)
29,1 (1 Mo.)
26,6 (1 Mo. 2 Wo.)
68,3 (1 Mo. 3 Wo.)
12,0 (5 Mo. 2 Wo.)
07
12,79 (1,5 Mo.)
1.9 (1,5 J.)
3,0 (16 J.)
1.9 (18 J.)
0,72 (20 J.)
0,26 (1,5 Mo.)
1,2 (1,5 J.)
1,2 (16 J.)
1,3 (18 J.)
1,43 (20 J.)
118,2 (5,5 J.)
127 (16, 5 J)
124 (18 J.)
142,8 (20 J.)
6,6 (5,5 J.)
5,5 (16,5 J.)
2,3 (18 J.)
3,7 (20 J.)
08
11,6 (2 Wo.)
9,07 (5 Mo.)
0,0 (2 Wo.)
0,19 (5 Mo.)
195,0 (2 Wo.)
11,2 (2 Wo.)
09
�
�
�
�
Tab. 2.3: Darstellung der gemessenen Neopterin- und Biopterinwerte im Urin (U) und im
Liquor (L). Die Anzahl der Messungen und das Alter der Patienten zum Zeitpunkt der Messung variiert
z.T. erheblich, weil nicht alle Patienten regelm��ig untersucht wurden und auch keine genormten Un-
tersuchungskriterien festgelegt wurden. � Daten sind nicht verf�gbar.
Von gr��ter Bedeutung sind f�r uns unter den zur Verf�gung stehenden Pa-
rametern die Messungen der Enzymaktivit�t, da eine verminderte Enzymak-
tivit�t sicherstes Indiz f�r funktionelle oder strukturelle Ver�nderungen des
Proteins in vivo darstellt. Desweiteren unterliegt die Enzymaktivit�t nicht den
Schwankungen, die bei Neopterin, Biopterin und den Neurotransmittermeta-
boliten gemessen werden. Die Schwankungen sind jeweils abh�ngig von Art
der Therapie, Therapiebeginn und �nderungen in der Dosierung, die sich
zum Teil auch in der klinischen Symptomatik widerspiegeln.
Page 63
Kapitel II – C : Patientendaten
56
Fast durchg�ngig erh�ht sind die Neopterinwerte, welche sich durch die The-
rapie mit BH4 kaum beeinflussen lassen. Im Liquor sind die Biopterinwerte
trotz Tetrahydrobiopterin-Substitution meist pathologisch erniedrigt, da die-
ses Pterin eine unzureichende Passage von der Peripherie ins ZNS aufweist
(Gal et al. 1976).
Pat.
5HIA (L)
mmol/l
HVA (L)
mmol/l
Klinik
01
�
�
Hypotonus, okkulare Abweichungen, Entwicklungsst�rung, Hypertonus
(10 M.)
02
194 (2 Wo.)
15 (1 Mo. 3 Wo.)
60 (10 J .6 Mo.)
18 (10 J. 7 Mo.)
7 (11 J. 9 Mo.)
536 (2 Wo.)
90 (1Mo. 3 Wo.)
503 (10 J. 6 Mo.)
124 (10 J. 7 Mo.)
110 (11 J. 9 Mo.)
Bei ausschlie�licher BH4-Therapie recht guter AGZ abgesehen von
Ataxie, Hypotonie, Dystonie der Mukulatur und abnormer Erm�dbarkeit.
Bei Absetzen der BH4-Substitution deutliche Verschlechterung der
Syptomatik.
03
14 (7 J.)
49 (7 J. 1 Mo.)
26 (14 J. 8 Mo.)
67 (17 J. 9 Mo.)
36 (19 J.)
98 (7 J.)
151 (7 J. 1 Mo.)
141 (14 J.8 Mo.)
155 (17 J. 9 Mo.)
140 (19 J.)
Bei Diagnosestellung mit erst 7 J. bereits psychomotorische
Retardierung, Gangst�rung, rezidivierende Krampfanf�lle. Nach
Therapie mit BH4 und Neurotransmittervorstufen Verbesserung aber
keine vollst�ndige Aufhebung der Retardierung. Patientin ist trotz
Therapie geistig wie k�rp. behindert.
04
345 (3 Wo.)
92 (7 Mo.)
827 (3 Wo.)
291 (7 Mo.)
unauff�llige Entwicklung bei regelm��iger BH4-Substitution
05
137 (14 J.)
10 (15J. 7 Mo.)
32 (15 J. 8 Mo.)
62 (16 J.)
490 (14 J.)
108 (15 J. 7 Mo.)
83 (15 J. 8 Mo.)
191 (16 J.)
Erhielt als Kleinkind lediglich phenylalaninarme Di�t (inkorrekte
Diagnose). Zunehmende psychomotorische Retardierung. Verbesserung
des AZ nach ad�quater Therapie. Nach kurzzeitigem Absetzen der
Medikation im Alter von 15 Jahren starke Verschlechterung mit
Krampfanf�llen.
06
390 (1 Mo.)
220 (1 Mo. 2 Wo.)
350 (1Mo. 3 Wo.)
172 (5 Mo. 2 Wo.)
132 (8 Mo.)
590 (1 Mo.)
380 (1 Mo. 2 Wo.)
600 (1 Mo. 3 Wo.)
395 (5 Mo. 2 Wo.)
385 (8 M.)
Im ersten Monat Hypertonus, Lethargie und Schluckprobleme, dann mit
phenylalaninarmer Di�t normale Entwicklung.
07
501 (5,5 J.)
102 (16,5 J)
40 (18 J.)
72 (20 J.)
333 (5,5 J.)
428 (16,5 J)
270 (18 J.)
166 (20 J.)
Als Kleinkind psychomotorischer Entwicklungsr�ckstand mit
ausgepr�gtem Hypotonus und mentaler Retardierung; sp�ter unter
ad�quat eingestellter Medikation normale Entwicklung bei gutem AGZ.
08
113 (2 Wo.)
68 (1 J. 6 Mo.)
231 (2 Wo.)
131 (1 J. 6 Mo.)
Entwicklungsst�rungen (8 T.), Verbesserung mit 2 Wochen; sp�ter noch
leichte Verz�gerung in der Entwicklung und Hypotonus aber
Verbesserung unter ad�quater Therapie
09
�
�
�
Tab. 2.4: Darstellung der ermittelten Neurotransmittermetabolite im Liquor (L) sowie der klini-
schen Symptomatik. Die Neurotransmittermetabolite 5-Hydroxy-Indolazetat (5HIA) und Homovanillin-
s�ure (HVA) sind infolge verringerter Neurotransmittersynthese bei Patienten mit der zentralen Form
der Erkrankung pathologisch erniedrigt, unterliegen jedoch therapieabh�ngigen Schwankungen.
� Daten sind nicht verf�gbar.
Page 64
Kapitel II – C : Patientendaten
57
Zum besseren Verst�ndnis der aufgef�hrten Werte und um die gemessenen
laborchemischen Parameter leichter einordnen zu k�nnen, sind abschlie�end
in der folgenden Tabelle alle Normwerte aufgef�hrt.
neonatal < 1 Jahr
2-4 J.
5-10 J.
11-16 J. >16 Jahre
Neo (U)
mmol/mol Kr.
1,1-4,0
1,1-4,0
1,1-4,0
1,1-4,0
0,2-1,7
0,2-1,7
Bio (U)
mmol/mol Kr.
0,5-3,0
0,5-3,0
0,5-3,0
0,5-3,0
0,5-2,7
0,5-2,7
Neo (L)
nmol/l
9-40
9-40
9-30
9-20
9-20
9-20
Bio (L)
nmol/l
10-50
10-50
10-40
10-30
10-30
10-30
5HIA (L)
nmol/l
144-800
114-336
105-299
88-178
74-136
66-141
HVA (L)
nmol/l
300-1000
295-932
211-871
144-801
133-551
115-488
PTPS (FB)
�U/mg %
1,9-2,4
1,9-2,4
1,9-2,4
1,9-2,4
PTPS (Ery)
�U/g Hb
34-64
34-64
34-64
34-64
11-29
11-29
Abb. 2.6: Darstellung der Normalwerte der Pterine in Urin (U) und Liquor (L), Neuro-
transmittermetabolite und der PTPS-Enzymaktivit�t in Fibroblasten (FB) und Erythro-
zyten (Ery).
Page 65
Kapitel III – A : Mutationen
58
KAPITEL III : ERGEBNISSE
A. �bersicht der gefundenen Mutationen
Im Rahmen der Untersuchung standen Proben von insgesamt neun Patien-
ten unterschiedlicher ethnischer Herkunft aus Deutschland und England zur
Verf�gung, die zur Mutationsanalyse eingehend sequenziert und zum Teil
zus�tzlich mittels Enzymverdau analysiert wurden.
Es wurden im ganzen zw�lf unterschiedliche Mutationen im codierenden Be-
reich des PTS-Gens nachgewiesen. F�nf waren homozygot, die �brigen sie-
ben lagen compound heterozygot vor. Es wurden eine Deletion und eine In-
sertion nachgewiesen, die �brigen zehn Mutationen bestanden in Sub-
stitution einzelner Basen. Darunter waren neun Missense-Mutationen und
eine Nonsense-Mutation. Nur zwei der Missense-Mutationen waren konser-
vativ (Austausch durch eine chem. verwandte AS), die �brigen sieben waren
nichtkonservativ (Austausch durch AS unterschiedlicher Strukturklasse bzw.
Polarit�t). Alle Mutationen waren lediglich auf die Exons 1, 2, 5 und 6 be-
schr�nkt wohingegen in Exon 3 und 4 keine Mutationen gefunden wurden.
Zus�tzlich konnte auch eine Substitution in Intron 2 (nichtcodierende Se-
quenz) nachgewiesen werden.
L
1
2
3
4
5
6
L
Abb. 3.1: Darstellung der PCR-Amplifikationsprodukte aller sechs Exons des
PTS-Gens mittels Gelelektrophorese (Agarose). Die Exons sind von 1-6 durchnume-
riert. L = Gr��enstandard (1 kb Leiter).
Page 66
Kapitel III – A : Mutationen
59
Die PCR-Amplifikationsprodukte aller sechs Exons des PTS-Gens sind in
Abb. 3.1 dargestellt. Die Ergebnisse der Sequenzierungen der Exons in Vor-
w�rts- und R�ckw�rtsrichtung sind detailliert in Teil B dieses Kapitels aufge-
f�hrt. In der unten abgebildeten Tabelle (Tab.3.1) sind alle im Rahmen dieser
Untersuchung gefundenen Mutationen in aufsteigender Reihenfolge (bezo-
gen auf die genomische DNA) dargestellt. Ferner sind die Basen�nderungen
sowie die Auswirkungen auf die resultierenden Aminos�uren aufgef�hrt. Die
in Intron 2 gefundene Basen�nderung (IVS2+14t>c), bei der es sich vermut-
lich nur um einen Polymorphismus handelt (s. Kap. IV-B), ist in der Tabelle
nicht dargestellt.
Nukleotid-
aberrationa
Mutation
(Trivialnahme)
b
Lokalisation
im PTS-Gen
Aminos�urenc
g.51_52insCGC
R17_I18insR
Exon 1
Insertion von Arg
g.65C>G
A22G
Exon 1
Ala(aliph.)>Gly(aliph.)
g.74G>A
R25Q
Exon 1
Arg(basisch)>Gln(neutral)
g.2121A>G
E35G
Exon 2
Glu(sauer)>Gly(aliph.)
g.2135_2138delTTTG
F40fsX56
Exon 2
Verschieb. d. Leserasters mit vorzeitigem
Kettenabbruch bei AS 56
g.6683C>T
P87L
Exon 5
Pro(Imino.)>Leu(aliph.)
g.6720C>A
Y99X
Exon 5
Tyr(arom.)>Stop
g.6725C>T
A101V
Exon 5
Ala(aliph.)>Val(aliph.)
g.6959A>G
Y113C
Exon 6
Tyr(arom.)>Cys(schwef.)
g.6994G>A
G125R
Exon 6
Gly(aliph.)>Arg(basisch)
g.7028A>G
D136G
Exon 6
Asp(sauer)>Gly(aliph.)
g.7033A>C
N138H
Exon 6
Asn(neutral)>His(arom./bas.)
Tab. 3.1: Tabellarische Auflistung aller entdeckten Mutationen in aufsteigender Reihenfolge im
PTS-Gen. a Die Numerierung der Nukleotide bezieht sich auf die genomische (g.) DNA-Sequenz
(GenBank L76259) und beginnt mit Adenosin des ATG-Start-Codons. b Sequenzver�nderung auf Pro-
tein-Ebene. Die Numerierung bezieht sich auf die Aminos�uresequenz, die AS sind durch
Ein-Buchstaben-Symbol abgek�rzt. c Effekt auf die betroffenen Aminos�uren. Die unterschiedlichen
Strukturklassen der jeweiligen Aminos�uren sind in Klammern angegeben (aliph. : aliphatisch ; Imino. :
Iminos�ure ; arom. : aromatisch ; schwef. : schwefelhaltig ; bas. : basisch).
Page 67
Kapitel III – A : Mutationen
60
In der folgenden Tabelle (Tab. 3.2) sind die untersuchten Patienten mit den
jeweils ermittelten Genotypen dargestellt. Die Basen�nderung in Intron 2
(IVS2+14c>t) wurde bei Patient 08 homozygot – zus�tzlich zu der Mutation
R25Q – nachgewiesen (nicht in Tabelle gezeigt).
Pat.-Nr.
Genotyp
01
[A22G]+[A22G] (homozygot)
02
[E35G]+[E35G] (homozygot)
03
[R17_I18insR]+[D136G] (compound heterozygot)
04
[P87L]+[Y113C] (compound heterozygot)
05
[Y99X]+[A101V] (compound heterozygot)
06
[N138H]+[N138H] (homozygot)
07
[G125R]+[G125R] (homozygot)
08
★[R25Q]+[R25Q] (homozygot)
09
[F40fsX56]+[Y99X] (compound heterozygot)
Tab. 3.2: Darstellung der unterschiedlichen Genotypen der untersuchten Pati-
enten. Die Mutationen sind mit den jeweiligen Trivialnamen bezeichnet (Ver�nde-
rung der AS-Sequenz); Nomenklatur entsprechend den aktuellen Empfehlungen
(Dunnen; Antonarakis 2000). ★ Bei Patient 08 wurde zus�tzlich eine Basen�nderung
in Intron 2 (IVS2+14t>c) gefunden.
Page 68
Kapitel III – B : Sequenzen
61
B. Sequenzen
Im Folgenden sind die Sequenzierungsergebnisse der unterschiedlichen
Mutationen aufgef�hrt. F�r jede Mutation ist jeweils ein Auszug der relevan-
ten Sequenz des codogenen und des komplement�ren DNA-Stranges sowie
die Kontrollsequenz eines nicht erkrankten Individuums dargestellt.
R17_I18insR (Exon 1)
Diese heterozygote, bei Patient 03 detektierte Mutation f�hrt zu einer Inser-
tion der drei Basen CGC zwischen den Codons 17 und 18 in Exon 1 und
verl�ngert somit das Translationsprodukt um die Aminos�ure Arginin. Eine
Verschiebung des Leserasters wird, da es sich um die Insertion eines kom-
pletten Codons handelt, nicht erzeugt (sogenannte „in-frame-Insertion“).
Weil nur ein Chromosom von der Insertion betroffen ist (Heterozygotie),
kommt es bei der Sequenzierung zu einer Verschiebung der beiden Sequen-
zen um drei Basen, was sich in einer �berlagerung der unterschiedlichen
Peaks im Bereich nach der Mutation darstellt (Abb. 3.2a).
Page 69
Kapitel III – B : Sequenzen
62
Abb. 3.2a: ★ Insertion des Triplets CGC in Exon 1 zwischen den Codons 17 und 18
(heterozygot)
Abb. 3.2b: Kontrolle der relevanten Sequenz in Exon 1
Abb. 3.2c: ★ Insertion des Triplets GCG auf dem komplement�ren DNA-Strang
G
T
C
C
C
G
C
C
G
C
M
K
C
W
Y
C
T
Y
C
W
T
★
G
T
C
C
C
G
C
C
G
C
A
T
C
T
C
C
T
T
C
A
G
C
G
★
G
A
T
G
C
G
G
C
G
G
S
R
S
A
M
T
W
S
T
T
S
★
Page 70
Kapitel III – B : Sequenzen
63
A22G (Exon 1)
Diese homozygote Mutation in Exon 1, die bei Patient 01 ermittelt wurde,
stellt sich in einer Substitution der Base Cytosin durch Guanin an Position 65
der genomischen DNA des PTS-Gens dar. Infolge der Mutation kommt es
durch die �nderung in Codon Nr. 22 im Translationsprodukt zu einem Aus-
tausch der Aminos�ure Alanin (GCG) durch Glycin (GGG).
Abb. 3.3a: ★ Substitution der Base C durch G an Position 65 der genomischen DNA in
Exon 1 des PTS-Gens (homozygot)
Abb. 3.3b: Kontrolle der relevanten Sequenz in Exon 1
Abb. 3.3c: ★ Substitution der Base G durch C auf dem komplement�ren DNA-Strang
G
G
A
G C
C
A
C
C
G
A
G
C
G
A
C
T
T
T
C
C
★
T
C
C
T
T
C
A
G
C
G
C
G
A
G C
C
A
C
C
G
A
★
T
C
G
G
T
G
G
C
T
C
C
C
G
C
T
G
A
A
G
G
A
★
Page 71
Kapitel III – B : Sequenzen
64
R25Q (Exon 1)
Diese Mutation in Exon 1, die bei Patient 08 homozygot beobachtet wurde
und bereits durch Th�ny und Oppliger beschrieben worden ist (Th�ny et al.
1994b; Oppliger et al. 1995a), stellt sich in der Substitution der Base Guanin
durch Adenin an Position 74 der genomischen DNA des PTS-Gens dar. Es
handelt sich in diesem Fall um eine „CpG-Mutation“ (s. Kap. IV - B). Das Co-
don Nr. 25 codiert somit nicht mehr f�r die Aminos�ure Arginin (CGA), son-
dern f�r die Aminos�ure Glutamin (CAA).
Abb. 3.4a: ★ Substitution der Base G durch A an Position 74 der genomischen DNA des
PTS-Gens in Exon 1 (homozygot)
Abb. 3.4b: Kontrolle der relevanten Sequenz in Exon 1
Abb. 3.4c: ★ Substitution der Base C durch T auf dem komplement�ren DNA-Strang
G
C
G
A
G C
C
A
C
C
A
A
T
T
G
T
A
C
A
G
G
★
G
C
G
A
G C
C
A
C
C
G
A
T
T
G
T
A
C
A
G
G
★
C
C
T
G
T
A
C
A
A
T
T
G
G
T
G
G
C
T
C
G
C
★
Page 72
Kapitel III – B : Sequenzen
65
E35G (Exon 2)
Diese Mutation in Exon 2, die bei Patient 02 homozygot gefunden wurde,
besteht in einer Substitution der Base Adenin durch Guanin an Position 2121
der genomischen DNA des PTS-Gens.
Das Codon Nr. 35 codiert somit nicht mehr f�r die Aminos�ure Glutamin-
s�ure (GAA) sondern f�r Glycin (GGA).
Abb. 3.5a: ★ Substitution der Base A durch G an Position 2121 der genomischen DNA des
PTS-Gens in Exon 2 (homozygot). Der Pfeil kennzeichnet das Ende des verwendeten Primers F2.
Die wellenartige Erhebung der Sequenz ist vermutlich Folge von unspezifischen Kettenabbr�chen,
wie sie h�ufiger direkt am Beginn einer Sequenz beobachtet wird. Sie wird wahrscheinlich durch
“Umklappen” der Anfangssequenz und somit Fehlpaarung verursacht.
Abb. 3.5b: Kontrolle der relevanten Sequenz in Exon 2
Abb. 3.5c: ★ Substitution der Base T durch C auf dem komplement�ren DNA-Strang
A
G
T
G
A
D
G
A
A
G
G
A
A
A
C
T
T
G
A
A
A
★
Primer F2
T
T
T
C
A
A
G
T
T
T
C
C
T
T
C
A
T
C
A
C
T
★
A
A
A
G
T
T
C
A
A
A
A
G
A
A
G
T
A
G
T
G
A
★
Page 73
Kapitel III – B : Sequenzen
66
Zus�tzlich zur Sequenzierung wurde f�r die Mutation E35G ein Enzymverdau
durchgef�hrt (s. Abb. 3.5d). Hierf�r wurde eigens ein modifizierter R�ck-
w�rtsprimer entwickelt, da durch die Mutation alleine keine palindromische
Sequenz entsteht (s. Kap. II - A 3 und II - B 4). Bei Verwendung der beschrie-
benen Primer (Kap. II-B 2.1+2.3) entsteht ein Amplifikationsprodukt von 119
Basen L�nge.
Bei Vorliegen der Mutation E35G entsteht die palindromische Sequenz
5`...GGAACC...3`, welche durch die Restriktionsendonuklease NlaIV mittig
gespalten wird. Als Resultat entstehen zwei Fragmente von 19 bzw. 100 Ba-
sen L�nge. Das k�rzere 19 Basen lange Fragment ist wegen seiner geringen
Gr��e auf dem Agarosegel nicht mehr darstellbar, weshalb man bei vorlie-
gen der homozygoten Mutation (M) nur eine Bande, die etwas schneller
wandert als die der 119 Basen langen Kontrollprodukte (K1-K4), erkennen
kann. L�ge die Mutation heterozygot vor, so w�re noch eine zus�tzliche
Bande (das gr��ere, ungespaltene Fragment von 119 Basen L�nge) sicht-
bar.
Abb. 3.5d: Enzymverdau des Amplifikationsproduk-
tes aus Exon 2 (modifizierter R�ckw�rtsprimer) mit
dem Restriktionsenzym BspLI (NlaIV). L: Gr��en-
standart (1kb Leiter); K1-K4: Kontrollen; M: Probe mit
Mutation (homozygot)
L
L
K1
K2
K3
K4
M
Page 74
Kapitel III – B : Sequenzen
67
Poly-T-Segment
Sechs Basen vor Exon 2 befindet sich eine Poly-T-Sequenz von 15 Basen
L�nge. Bei Verwendung des Vorw�rtsprimers „Exon 2 F“ (Tab. 2.1), welcher
sich vor der besagten Sequenz anlagert, kommt es bei Sequenzierung in
Vorw�rtsrichtung am Ende des Poly-T-Segmentes zu einem Abri� der lesba-
ren Sequenz (Abb. 3.6), die dazu f�hrt, da� die nachfolgende Sequenz in
Vorw�rtsrichtung unlesbar wird. Vermutlich kommt es nach dem Poly-T-
Segment zu unspezifischen Kettenabb�chen.
Um den Bereich trotzdem vorw�rts sequenzieren zu k�nnen, wurde ein
zweiter Primer, der sich erst sp�ter an die DNA-Template anlagert
(Exon 2 F2) hergestellt.
Abb. 3.6: „Abri�“ der Sequenz nach dem Poly-T-Segment vor Exon 2 bei Verwendung des
ersten Vorw�rtsprimers (s. Protokolle 2.1)
T G A T A C T T G T G T C A T G C T G A C T T T T T T T T T T T T T T K G G G C V R D A A A T T T Y H A A R G G
Page 75
Kapitel III – B : Sequenzen
68
F40fsX56 (Exon 2)
Diese heterozygote bei Patient 09 beobachtete Mutation in Exon 2 zeichnet
sich durch eine Deletion der vier Basen TTTG an Position 2135-2138 der
genomischen DNA des PTS-Gens aus. Weil nur ein Chromosom von der
Mutation betroffen ist, verschieben sich im Bereich nach der Mutation die
beiden L�ufe bei der Sequenzierung um 4 Basen, wodurch eine �berlage-
rung der Peaks die Sequenz schlecht lesbar macht. Zus�tzlich ist eine Re-
duktion der Peaks auf etwa die H�lfte ihrer urspr�nglichen H�he deutlich er-
kennbar (Abb. 3.7b).
Weil von der Deletion keine kompletten Codons betroffen sind, kommt es
infolge der Mutation zu einer Verschiebung des Leserasters (Frameshift) und
somit zu einer Ver�nderung der Aminos�uren im Genprodukt (Abb. 3.8a).
Infolge der Leserasterverschiebung kommt es zum fr�hzeitigen Entstehen
eines Stopcodons und somit zum Translationsabbruch bereits bei Codon 56.
Abb. 3.7a: A: Sequenz im Bereich der Deletion der vier Basen TTTG in Exon 2 des PTS-
Gens; B: Kontrollsequenz. In der ersten Zeile ist jeweils die Nummer des Codons, in der zweiten
die Sequenz und in der dritten die resultierende Aminos�ure angegeben. Der graue Balken
kennzeichnet die durch die Deletion ver�nderten Aminos�uren und der kleine Kasten die Deletion.
037 038 039 040 041 042 043 044 045 046 047 048 049 050
TTG AAA CTG TTT GGG AAA TGC AAC AAT CCA AAT GGC CAT GGG
Leu Lys Leu Phe Gly Lys Cys Asn Asn Pro Asn Gly His Gly
037 038 039 040 041 042 043 044 045 046 047 048 049 050
TTG AAA CTG GGA AAT GCA ACA ATC CAA ATG GCC ATG GGC ACA
Leu Lys Leu Gly Asn Ala Thr Ile Gln Met Ala Met Gly Thr
↓
Del
A
B
Page 76
Kapitel III – B : Sequenzen
69
Abb. 3.7b: ↓ Deletion der vier Basen TTTG in Exon 2 an Position 2135-2138 der genomischen
DNA des PTS-Gens (heterozygot)
Abb. 3.7c: Kontrolle der relevanten Sequenz in Exon 2. ★ Die von der Deletion betroffenen
Basen (TTTG) sind durch die Klammer gekennzeichnet.
Abb. 3.7d: ↓ Deletion der vier Basen CAAA auf dem komplement�ren DNA-Strang
(heterozygot)
A
C
T
T
G
A
A
A
C
T
G
G
G
T
G
R
T G
C
A
T
C G M
↓
Del
A
C
T
T G
A
A
A
C
T
G
T
T
T
G
G
G
A A
A
T
G
C
A
★
T
G
C
A
T
T
T
C
C
C
A
R
W
Y
W
S
A
A
G
Y
T
W
G
C
↓
Del
Page 77
Kapitel III – B : Sequenzen
70
IVS2+14t>c (Intron 2)
Die Substitution der Base Thymin durch Cytosin an Position 2194 der geno-
mischen DNA des PTS-Gens (Im Intronbereich, 14 Basen nach Exon 2) wur-
de bei Patient 08 homozygot nachgewiesen (Abb. 3.8a), zus�tzlich zu der
Mutation R25Q, die ebenfalls homozygot auftrat. Es liegt in diesem Fall eine
Mutation des CpG-Dinukleotids (s. Kap IV-B) vor. Bei dieser Basen�nderung
im Intronbereich handelt es sich vermutlich nicht um eine krankheitsausl�-
sende Mutation, sondern um einen Polymorphismus (s. Kap. IV - B).
Abb 3.8a: ★ Substitution der Base T durch C an Position 2194 der genomischen DNA des
PTS-Gens im Intron nach Exon 2 (homozygot)
Abb. 3.8c: Kontrolle der relevanten Sequenz (4-24 Basen nach Exon 2)
T
T
T
A
C
A
G
T
A
G
C
C
A
A
A
A
A
G
A
G
A
★
T
T
T
A
C
A
G
T
A
G
T
C
A
A
A
A
A
G
A
G
A
★
Page 78
Kapitel III – B : Sequenzen
71
P87L (Exon 5)
Diese Mutation in Exon 5, die bei Patient 04 heterozygot vorliegt, besteht in
einer Substitution der Base Cytosin durch Thymin an Position 6683 der
genomischen DNA des PTS-Gens (Abb. 3.9a) und wurde bereits von Oppli-
ger beschrieben (Oppliger et al. 1995a).
Das Codon Nr. 87 codiert somit nicht mehr f�r die Aminos�ure Prolin (CCC)
sondern f�r Leucin (CTC).
Abb. 3.9a: ★ Substitution der Base C durch T bei Position 6683 der genomischen DNA des PTS-
Gens in Exon 5 (heterozygot)
Abb. 3.9b: Kontrolle der relevanten Sequenz in Exon 5
Abb. 3.9c: ★ Substitution der Base G durch A auf dem komplement�ren DNA-Strang
A
T
T
A
T
G
C
A
G
C
Y
C
C
T
T
G
A
T
C
A
T
★
A
T
T
A
T
G
C
A
G
C
C
C
C
T
T
G
A
T
C
A
T
★
A
T
G
A
T
C
A
A
G
G
G
G
C
T
G
C
A
T
A
A
T
★
Page 79
Kapitel III – B : Sequenzen
72
Y99X (Exon 5)
Die Mutation Y99X wurde in zwei F�llen des untersuchten Patientenkollektivs
jeweils in heterozygoter Form, sowohl bei Patient 09 (Abb. 3.10a) als auch
bei Patient 05 (Abb.3.11a), nachgewiesen. Bei Patient 05 wurde in Exon 5
zus�tzlich unmittelbar benachbart die Mutation A101V gefunden. Die Sub-
stitution der Base Cytosin durch Adenin an Position 6720 der genomischen
DNA des PTS-Gens ver�ndert das Codon Nr. 99, welches zuvor f�r die Ami-
nos�ure Tyrosin (TAC) codierte zu einem Stopcodon (TAA).
Abb. 3.10a: ★ Substitution der Base C durch A an Position 6720 der genomiscen DNA des
PTS-Gens in Exon 5 (heterozygot)
Abb. 3.10b: Kontrolle der relevanten Sequenz in Exon 5
Abb. 3.10c: ★ Substitution der Base G durch T auf dem komplement�rem DNA-Strang
A
T
G
T
G
C
C
A
T
A
M
T
T
T
G
C
A
G
A
T
G
★
A
T
G
T
G
C
C
A
T
A
C
T
T
T
G
C
A
G
A
T
G
★
C
A
T
C
T
G
C
A
A
A
K
T
A
T
G
G
C
A
C
A
T
★
Page 80
Kapitel III – B : Sequenzen
73
A101V (Exon 5)
Die Mutation A101V in Exon 5, die bei Patient 05 heterozygot und dort in
unmittelbarer Nachbarschaft zur Mutation Y99X vorliegt (Abb. 3.11a), zeigt
sich in der Substitution der Base Cytosin durch Thymin an Position 6725 der
genomischen DNA des PTS-Gens.
Das Codon Nr. 101 codiert somit nicht mehr f�r die Aminos�ure Alanin
(GCA) sondern f�r Valin (GTA).
Abb. 3.11a: ★1 Substitution der Base C durch A an Position 6720 und ★2 der Base C durch T
an Position 6725 der genomischen DNA des PTS-Gens in Exon 5 (jeweils heterozygot)
Abb. 3.11b: Kontrolle der relevanten Sequenz in Exon 5
Abb. 3.11c: ★2 Substitution der Base G durch A und ★1 Substitution der Base G durch T auf
dem komplement�ren DNA-Strang
T
G
C
C
A
T
A
M
T
T
T
G
Y
A
G
A
T
G
T
G
★1
★2
Y9
9
X
A1
0
1
V
T
G
C
C
A
T
A
C
T
T
T
G
C
A
G
A
T
G
T
G
★
★
C
A
C
A
T
C
T
R
C
A
A
A
K
T
A
T
G
G
C
A
★2
★1
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Kapitel III – B : Sequenzen
74
Y113C (Exon 6)
Die Mutation Y113C in Exon 6, die bei Patient 04 heterozygot vorliegt, be-
steht in einer Substitution der Base Adenin durch Guanin an Position 6959
der genomischen DNA des PTS-Gens.
Das Codon Nr. 113 codiert somit nicht mehr f�r die Aminos�ure Tyrosin
(TAT) sondern f�r Cystein (TGT).
Abb. 3.12a: ★Substitution der Base A durch G an Position 6959 der genomischen DNA des
PTS-Gens in Exon 6 (heterozygot)
Abb. 3.12b: Kontrolle der relevanten Sequenz in Exon 6
Abb. 3.12c: ★ Substitution der Base T durch C auf dem komplement�ren DNA-Strang
G
T
A
G
C
T
G
T
T
T
R
T
A
T
C
T
G
G
G
A
C
★
G
T
A
G
C
T
G
T
T
T
A
T
A
T
C
T
G
G
G
A
C
★
G
T
C
C
C
A
G
A
T
A
Y
A
A
A
C
A
G
C
T
A
C
★
Page 82
Kapitel III – A : Ergebnisse
75
G125R (Exon 6)
Die Mutation G125R in Exon 6, die bei Patient 07 homozygot vorliegt, zeigt
sich in einer Substitution der Base Guanin durch Adenin an Position 6994 der
genomischen DNA des PTS-Gens.